论文摘要
目的构建携带单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因（HSV1-tk）的重组质粒和重组腺病毒载体,对比研究重组腺病毒和脂质体包裹的重组质粒体外转导乳鼠心肌细胞后,对核素标记的报告探针131I-FIAU的摄取和基因表达情况,为核素报告基因心脏显像寻找合适的载体并提供基础。方法1.重组质粒与重组腺病毒的构建及鉴定以含巨细胞病毒（CMV）启动子的pDC316为载体质粒,将报告基因HSV1-tk插入多克隆位点,构建重组质粒pDC316-tk;以pDC316-tk作为重组穿梭质粒,与腺病毒骨架质粒共转染293细胞,包装生成腺病毒重组体Ad5-tk,本部分与北京本元正阳公司合作完成。含增强型绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒Ad5-EGFP作为对照病毒。2.SD大鼠乳鼠心肌细胞培养无菌操作取1～3 d龄SD大鼠乳鼠心室组织,剪成1mm3的组织碎块,采用0.1% II型胶原酶单次消化法消化组织块,1 h差速贴壁法纯化心肌细胞,于37℃、5%CO2环境下培养。生物倒置显微镜下动态观察心肌细胞形态。3.脂质体包裹重组质粒转染体外培养的心肌细胞心肌细胞贴壁生长达90%融合时,重组质粒pDC316-tk经脂质体lipofectamineTM 2000包裹（pDC316-tk/lipoplex）后加入培养孔内,37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育4h后将转染液替换为含血清培养基,继续培养至24h。4.重组腺病毒感染体外培养的心肌细胞心肌细胞贴壁生长达90%融合时,计数培养孔内心肌细胞数目,以感染复数（MOI）20、40、80计算所需病毒体积,opti-MEM稀释后加入培养孔中,37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育4h后换成含血清培养基,继续培养至24h。5.FAU的碘化标记采用Iodogen固相氧化法对FAU进行放射性碘标记,标记产物用Sep-Pak C-18反相色谱层析柱进行纯化和标记率分析,TLC-SG硅胶板薄层层析法测定131I-FIAU的放射化学纯度和体外稳定性。6.Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex转导心肌细胞后体外摄取及基因表达的比较心肌细胞转导Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex后37℃孵育24h,进行131I-FIAU的摄取实验,比较两种载体介导细胞转导后对报告探针的摄取效率;应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学方法,分别在mRNA和蛋白质水平检测不同载体转导后心肌细胞内HSV1-tk的表达情况;用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法评价转导后心肌细胞活力。结果1.与本元正阳公司协作构建的重组质粒pDC316-tk经PCR、酶切鉴定和测序鉴定证明序列正确,包装生成的重组腺病毒Ad5-tk的物理滴度（v.p./ml）为1.1×1012,感染滴度（TCID50/ml）达1.6×1010。2. 0.1% II型胶原酶单次消化法获得的心肌细胞活力强,培养24h后,倒置显微镜下见心肌细胞相互交联,部分心肌细胞成团跳动,48h可见多个细胞集落同步跳动。3. Iodogen固相氧化法能有效碘化标记FAU,标记反应产物经Sep-Pak C-18反相色谱柱纯化后,峰管的标记率为（53.82±2.05）%。经TLC-SG硅胶板层析测定放射化学纯度为（94.85±1.76）% （n=5）。标记物在室温下放置4、12、24h后,放射化学纯度仍大于90%。4. Ad5-tk和pDC316-tk/lipoplex转导的心肌细胞对131I-FIAU的摄取均随时间延长逐渐增加,在5h达最高摄取率,分别为（12.55±0.37）%,（2.09±0.34）%,但前者各时间点摄取率均高于后者（P<0.01）。两种载体介导心肌细胞转导后24h,RT-PCR即可检测到HSV1-tk mRNA的表达,且Ad5-tk感染组的表达水平明显高于pDC316-tk/lipoplex转染组（3.11±0.14 vs 1.60±0.05, P<0.01）;免疫细胞化学检测显示Ad5-tk感染组和pDC316-tk/lipoplex转染组的阳性率分别为（81.70±0.40）%、（22.06±0.32）%,差异有统计学意义（P<0.01）;MTT实验结果显示,心肌细胞感染高滴度Ad5-tk后细胞活力下降较pDC316-tk/lipoplex转染组明显。结论用重组腺病毒和脂质体包裹重组质粒做载体,均能成功介导报告基因HSV1-tk进入心肌细胞,并表达生成有生物活性的酶对核素标记报告探针131I-FIAU有明确的摄取,但通过腺病毒载体介导具有明显高的转导效率,对标记探针的摄取率也明显高于脂质体介导组。因此,合适滴度的重组腺病毒可作为活体报告基因心脏显像的载体,这为得到更为清晰的核素报告基因显像图像提供了理论基础。