逐渐干旱对牡丹实生苗生理指标的影响和牡丹GA20-氧化酶基因的克隆与序列分析

论文摘要

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是我国的传统名花,其观赏栽培已经有1600多年的历史。前人对不同干旱胁迫下,牡丹的光和特性,生理特性和荧光特性等方面都做了较深入研究,但干旱胁迫对牡丹实生苗砧木的光和特性和生理特性影响的研究未曾涉及,本论文以牡丹实生苗‘凤丹’（Paeonia ostii‘Feng Dan’）为试材,研究了逐渐干旱对牡丹实生苗叶绿素含量、光合作用、CAT活性等生理指标的变化。同时,以牡丹品种“洛阳红”（Paeonia suffruticosa‘Luoyanghong’）为试材,克隆牡丹GA20-氧化酶基因,得到其中间片段,为今后克隆cDNA全长和了解赤霉素在牡丹生长发育以及形态建成过程中有重要意义。本试验研究主要有如下结论:1.随着干旱胁迫的加剧,叶绿素含量呈先升后降趋势,轻度干旱时达到最大值比干旱前上升18.6%,重度干旱时达到最低值比干旱前下降了51.2%;净光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度均逐渐下降,重度干旱时都达到最低值,分别比干旱前下降了88%,78.6%,89.4%,蒸腾速率呈现先升后将趋势,中度干旱达到最大然后逐渐减小,重度干旱时达到最小值比干旱前下降了50%,表明牡丹实生苗的光合作用受到一定程度抑制。CAT活性变化在根与叶中表现不同。叶中CAT活性随干旱程度的加剧先升高后降低,但整体来说,干旱胁迫下叶中CAT活性均比干旱前有所提高,从而一定程度上提高了牡丹实生苗的抗旱性。根中的CAT活性呈逐渐降低趋势,需要进一步研究。2.根据根据已测序牡丹品种‘鲁菏红’GA20-氧化酶基因（GenBank登陆号为:EF607139）的核苷酸序列,设计GA20-氧化酶基因的特异引物PSGA20-1和PSGA20-2。然后通过RT-PCR扩增目的片段,获得186bp的目的片段,命名为PSGA20-ox,编码61个氨基酸。3.将牡丹的PSGA20-ox基因片段与GeneBank中报道的牡丹（EF607139.1）、毛果杨（XM002307005.1）、陆地棉（AY895169）、豌豆（X91658）、菜豆（PVU70530）、葡萄（DQ508817.1）、胡萝卜（AB067635）等植物进行BLAST比对,同源性均达70%以上。利用DNAMAN软件将克隆出的PSGA20-ox与GeneBank中登录的毛果杨、陆地棉、豌豆、菜豆、葡萄、胡萝卜等植物GA20-ox的氨基酸序列进行BLAST比对并对同源性分析结果构建GA20-ox蛋白的系统发生树,可知牡丹与毛果杨、夹竹桃等的亲缘关系较近,与胡萝卜、葡萄等的亲缘关系较远。4.将PSGA20-ox的氨基酸序列在NCBI上搜索保守结构域（CD-SEARCH）。结果显示,PSGA20-ox与依赖2-酮戊二酸和Fe2+的加氧酶超家族（2OG-Fe（II） oxygen- ase superfamily）蛋白高度同源,E值为2e-23,共含有86个氨基酸。依赖2-酮戊二酸和Fe2+的加氧酶超家族包含脯氨酸4-羟化酶α亚基的C末端。这个全酶能催化此类反应:溶胶原-左旋蛋白+2-酮戊二酸+O2=反式溶胶原-4-羟基-左旋蛋白+丁二酸酯+CO2。整个酶包含2α,2β和具有许多活性位点的α亚基。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 赤霉素的研究进展
• 1.1.1 赤霉素简介
• 1.1.2 赤霉素的合成途径
• 1.1.2.1 赤霉素合成的前体——牻牛儿牻牛儿焦磷酸（GGPP）的形成途径
• 1.1.2.2 赤霉素合成途经
• 1.1.3 赤霉素的信号转导
• 1.1.3.1 GA 信号转导途径中的组成元件及其功能
• 1.1.3.2 GA 的信号转导模型
• 1.2 GA20 氧化酶的研究进展
• 1.2.1 GA20-氧化酶及其基因
• 1.2.2 GA20-氧化酶基因表达与调控
• 1.2.2.1 反馈调节
• 1.2.2.2 光照调节
• 1.2.2.3 温度调节
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
• 3.1 逐渐干旱对牡丹实生苗生理指标的影响
• 3.1.1 试验材料与干旱处理
• 3.1.2 试验方法
• 3.1.2.1 光合特性的测定方法
• 3.1.2.2 叶绿素含量的测定
• 3.1.2.3 过氧化氢酶（CAT）活性测定
• 3.2 牡丹GA20-氧化酶基因的克隆与分析
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 菌株与载体
• 3.2.3 工具酶及生化试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 PCR 引物
• 3.2.6 总RNA 的提取与质量鉴定
• 3.2.6.1 总 RNA 的提取前的准备工作
• 3.2.6.2 改良CTAB 法提取RNA 的方法步骤
• 3.2.6.3 总 RNA 的质量鉴定
• 3.2.7 反转录
• 3.2.9 PCR 产物的检测与回收纯化
• 3.2.10 回收产物与载体的连接
• 3.2.11 感受态细胞的制备
• 3.2.12 连接产物转化大肠杆菌
• 3.2.13 碱裂解法小量制备质粒DNA
• 3.2.14 酶切鉴定
• 3.2.15 序列测定
• 3.2.16 序列分析
• 4. 结果与分析
• 4.1 逐渐干旱对牡丹生理指标的影响
• 4.1.1 逐渐干旱对牡丹实生苗叶绿素含量变化的影响
• 4.1.2 干旱胁迫对牡丹实生苗光合作用的影响
• 4.1.3 干旱胁迫对牡丹实生苗过氧化氢酶（CAT）活性的影响
• 4.2 分子实验结果分析
• 4.2.1 牡丹RNA 质量检测结果及反转录第一链的获得
• 4.2.2 牡丹GA20-氧化酶基因片段的克隆
• 4.2.2.1 GA20-氧化酶基因片段的 PCR 产物电泳结果
• 4.2.2.2 GA20-氧化酶基因片段的 PCR 产物回收结果和酶切鉴定
• 4.2.3 牡丹GA20-氧化酶基因片段的序列分析
• 4.2.3.1 牡丹GA20-氧化酶基因片段的测序结果
• 4.2.3.2 牡丹GA20-氧化酶基因片段的氨基酸序列分析
• 4.2.4 牡丹GA20-氧化酶基因片段的蛋白保守结构域分析
• 5. 讨论
• 5.1 逐渐干旱下牡丹实生苗生理指标的变化
• 5.2 GA20-氧化酶的研究前景
• 参考文献
• Abstract