论文题目: 实时荧光PCR检测肠出血性大肠杆菌O157和禽流感H5亚型的研究
论文类型: 硕士论文
论文专业: 细胞生物学
作者: 于广福
导师: 沈明山,陈亮
关键词: 实时荧光技术,型荧光探针,肠出血性大肠杆菌,禽流感亚型
文献来源: 厦门大学
发表年度: 2005
论文摘要: 实时荧光PCR技术具有高灵敏度、高特异性、无需PCR反应后处理步骤等优点,近年来被广泛应用于分子生物学研究领域,尤其在临床检验方面,该技术提供了有力的支持。针对日益完善的实时荧光PCR技术和种类越来越多的荧光探针技术,本研究设计了一种新型的荧光探针——等长双链荧光探针,又称Y型荧光探针,并围绕该关键技术展开了研究。研究工作主要包括Y型荧光探针的设计组合,应用Y型荧光探针对常见的病原微生物进行实时定量的检测。文章分为两部分。在第一部分,首先,我们对不同组合的Y型荧光探针进行了筛选、优化,找到最佳的检测探针组成。然后,我们以肠出血性大肠杆菌O157为检测目标,以该细菌的rbfE基因为检测靶序列,从探针的熔解曲线、检测的特异性和灵敏度等几个方面系统的考察了新型Y型荧光探针检测细菌DNA的效果。通过实验,我们可以特异地从肠出血性大肠杆菌O157 ,伤寒沙门氏菌,福氏志贺菌,肠侵袭性大肠杆菌O4,弗劳地氏枸橼酸杆菌,产毒素大肠杆菌等16株常见菌中检测出肠出血性大肠杆菌O157。另外,以肠出血性大肠杆菌O157阳性标准株10倍的梯度稀释液作为检测灵敏度的模板,结果可以在1.49×103 CFU/mL浓度下特异地检测出目的菌。第二部分,应用新型Y型荧光探针对禽流感H5亚型病毒进行了检测实验。我们选择保守的HA基因作为靶序列,系统优化了检测RNA病毒的Y型荧光探针反应体系和反应条件。结果表明,由Y型荧光探针建立的检测体系可以在1.5 h左右特异地检测出高致病力的禽流感H5亚型。通过对病毒标准株RNA的梯度稀释,
论文目录:
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英文摘要
第一部分 实时荧光 PCR 检测肠出血性大肠杆菌 0157 的研究
1 引言
1.1 实时荧光PCR 应用的荧光探针技术
1.1.1 分子信标
1.1.2 TaqMan 探针或水解探针
1.1.3 杂交探针
1.1.4 双链荧光探针
1.1.5 荧光标记引物
1.1.6 SYBR Green I 荧光染料
1.2 实时荧光PCR 在临床检测上的应用
1.3 肠出血性大肠杆菌0157 的研究
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 主要试剂
2.3 引物和Y 型荧光探针的设计与合成
2.3.1 检测rbf E 基因的引物和Y 型荧光探针的设计合成
2.3.2 茎、尾长度不同的Y 型荧光探针的设计合成
2.3.3 生物素探针捕获实验设计
2.3.4 其他毒力基因的设计合成
2.4 主要仪器
2.5 常用溶液的配制
2.6 实验方法
2.6.1 模板准备
2.6.2 rbf E 基因的扩增
2.6.3 Y 型荧光探针的熔解曲线
2.6.4 不同荧光探针的熔解曲线
2.6.5 Y 型荧光探针的特异性实验
2.6.6 荧光探针的灵敏度实验
2.6.7 其它实验
2.6.8 电泳检测
3 结果
3.1 普通PCR 对rbf E 基因片段的扩增结果
3.2 Y 型荧光探针的反应原理
3.3 Y 型荧光探针的熔解曲线
3.4 不同荧光探针的熔解曲线
3.5 Y 型荧光探针特异性实验结果
3.5.1 Y 型荧光探针与合成靶序列的变温反应
3.5.2 实时荧光PCR 反应检测样品的结果
3.6 Y 型荧光探针灵敏度实验结果
3.7 磁珠捕获实验结果
3.8 多重PCR 反应实验结果
4. 讨论
4.1 Y 型荧光探针的作用原理
4.2 Y 型荧光探针的优化
4.3 检测肠出血性大肠杆菌0157 的实时荧光PCR 体系
4.4 磁珠捕获体系和多重PCR 体系的建立
4.5 待解决的问题
小结
参考文献
第二部分 实时荧光 PCR 检测禽流感 H5 亚型的研究
1 引言
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
2.4 引物与荧光探针的设计与合成
2.5 常用溶液的配制
2.6 实验方法
2.6.1 禽流感病毒RNA 的提取
2.6.2 病毒RNA 的反转录
2.6.3 HA 基因的克隆
2.6.4 PCR 产物的纯化
2.6.5 DNA 连接反应
2.6.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.6.7 连接产物转化感受态细胞
2.6.8 阳性克隆的筛选
2.6.9 Y 型荧光探针的特异性实验
2.6.10 反转录－实时荧光PCR 体系的建立
2.6.11 Y 型荧光探针检测病毒RNA 特异性实验
2.6.12 Y 型荧光探针检测病毒RNA 灵敏度实验
3 结果
3.1 病毒RNA 反转录PCR 扩增的结果
3.2 pMD18-HA 质粒的构建
3.3 Y 型荧光探针的特异性实验
3.3.1 与靶序列的变温曲线实验
3.3.2 实时荧光PCR 检测pMD18-HA 实验
3.4 Y 型荧光探针检测病毒RNA 体系的优化
3.5 Y 型荧光探针检测H5 亚型禽流感病毒RNA 的特异性实验.
3.6 Y 型荧光探针检测病毒RNA 灵敏度的实验
4. 讨论
小结
参考文献
附录
硕士期间获得奖励
硕士期间发表文章
致谢
发布时间: 2006-12-11
参考文献
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标签：实时荧光技术论文; 型荧光探针论文; 肠出血性大肠杆菌论文; 禽流感亚型论文;