短芒大麦钠质子逆向转运蛋白基因表达载体的构建及水稻遗传转化的初步研究

论文摘要

水稻是最重要的粮食作物之一,全世界约有三分之一的人口以水稻作为主要的食物。因此,提高水稻产量,改良稻米品质关系到人类的生存、发展和健康。人们通过系谱选择、有性杂交、诱变育种的方法,将许多近缘品种的优良性状组合到一起。但是由于存在生殖隔离,这就使植物遗传改良在很大程度上受到了限制。始于20世纪70年代的植物基因工程研究为拓宽植物可利用基因库提供了新的可能,从而为植物的遗传改良开辟了一条新的途径。 植物转基因研究的目的是利用分子生物学和基因工程技术将外源基因插入、整合到受体植物的基因中,并使其在后代植株中得以遗传和表达,从而使受体植物获得新的性状。自1983年第一株转基因植物（烟草）的获得,开始了利用转基因技术改良植物种性的时代;1985年Horsh等人首创了叶盘转化法,使得农杆菌转化过程大为简化,从此植物基因转化研究得到迅速发展。 短芒大麦[Hordeum brevisubulatum（Trin.）Link]是禾本科大麦属中的一种多年生草本植物,俗称野大麦。广泛分布于我国的东北、华北、内蒙、青海及新疆等地,其优点是耐寒、耐盐碱、分蘖力强等特点。近几年来,我们以短芒大麦为材料,已对其生理、生化特性和耐盐突变体进行了大量研究。 Na+液泡内区域化是植物特别是盐生植物适应Na+毒害的一种非常有效的手段,液泡型Na+/H+逆向转运蛋白在这一过程中起重要的作用。本文从短芒大麦中克隆了液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因的全长cDNA序列,命名为HbNHX1。生物信息学分析表明,HbNHX1含有11个跨膜区。HbNHX1与已克隆的Na+/H+逆向转运蛋白的系统进化树分析显示,它同液泡型Na+/H+逆向转运蛋白的同源性较高,约在55.3-74.8%之间,与质膜型Na+/H+逆向转运蛋白的同源性较低,在18.3-21.8%之间,说明HbNHX1属于典型液泡型Na+/H+逆向转运蛋白。RT-PCR方法分析表明在转录水平HbNHX1基因在根和幼苗中均表达,但在幼苗中表达量较为丰富;该基因在转录水平不受盐胁迫诱导表达。为了进一步鉴定HbNHX1基因的功能,本文将从短芒大麦中克隆的液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因HbNHX1构建植物高效表达载体pBRNHX,并利用农杆菌介导法转化重要粮食作物水稻。结果获得了20棵转基因植株,PCR、PCR-Southern及RT-PCR结果表明HbNHX1基因已经整合到转基因水稻的核基因组上,并能够在转录水平表达。为水稻的抗逆性遗传改良奠定了良好的基础。

论文目录

• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 植物盐害
• 1.1 离子过量
• 1.2 离子亏缺
• 1.3 活性氧的伤害
• 第二章 植物的耐盐机理
• 2.1 植物在形态上的耐盐
• 2.2 生理性耐盐
• 2.2.1 渗透调节
• 2.2.2 离子的区域化
• 2.2.2.1 质子泵（proton pump）
• 2.2.2.2 离子通道（ion channel）和离子运输载体（ion porter/carrier）
• +/H⁺逆向转运蛋白'>2.2.2.3 液泡型 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• 2.3 维持膜结构的完整性
• 2.4 改变代谢途径
• 2.5 拒盐与对离子的选择吸收维持膜结构的完整性
• 2.6 分子水平的抗盐
• 2.7 自由基消除系统活性增加
• 2.8 水分的促进运输
• 2+在盐胁迫中的作用'>2.9 ca²⁺在盐胁迫中的作用
• 2.10 外源物质对植物耐盐性的作用
• 第三章 植物的耐盐遗传育种
• 3.1 植物耐盐性鉴定方法的研究
• 3.2 植物耐盐遗传育种
• 3.2.1 杂交育种
• 3.2.2 大田选育法
• 3.2.3 组织培养法
• 3.2.4 突变体选择法红景天甙生物合成相关酶
• 3.2.5 植物耐盐基因工程植物中的UDP-葡萄糖基转移酶
• 第二篇 研究内容
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的分离及特性分析'>第一章 短芒大麦液泡型 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的分离及特性分析
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 总RNA的提取
• 1.2.2 HbNHX1基因保守区序列的获得
• 1.2.3 HbNHX1基因3’端序列的克隆
• 1.2.4 HbNHX1基因5’端序列的克隆
• 1.2.5 HbNHX1基因的电子合并及全长cDNA的克隆
• 1.2.6 HbNHX1基因的生物信息学分析
• 1.3 讨论
• +/H⁺逆向转运蛋白基因与植物的耐盐性'>1.3.1 液泡型Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因与植物的耐盐性
• 1.3.2 植物材料及基因克隆方法的选择
• 1.3.3 HbNHX1基因的分离与分析
• 1.4 小结
• 第二章 短芒大麦钠质子逆向转运蛋白基因水稻遗传转化的初步研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 pBRNHx表达载体的构建
• 2.2.2 水稻的遗传转化及初步筛选
• 0代转基因水稻的获得及分子检测'>2.2.3 HbNHX1 T₀代转基因水稻的获得及分子检测
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• CURRICULUM VITAE
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介