沙眼衣原体培养阳性率提高及临床株热休克蛋白60的转录随传代的变化

论文摘要

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, Ct）感染是目前发达最常见的性病病原体,可引起尿道炎、宫颈炎、子宫内膜炎、附睾炎、前列腺炎、不孕症多种疾病,且发病率呈逐年上升趋势,已经成为一个危害极大的公共健康问题。沙眼衣原体检测的金标准目前仍然是细胞培养。但是细胞培养并未在临床工作中广泛采用。而且,临床株的培养是体外药物敏感试验的基础。因此,提高沙眼衣原体细胞培养检出的阳性率显得尤为重要。另外,导致沙眼衣原体感染治疗失败的一个重要原因是沙眼衣原体的持续感染,持续感染时碘染不能看到典型的包涵体且沙眼衣原体热休克蛋白60含量增加。目的：1、探讨聚乙二醇（PEG）促进沙眼衣原体D-UW-5/Cx型、E-UW-5/Cx型标准株生长的最适浓度及聚乙二醇对沙眼衣原体D-UW-5/Cx型、E-UW-5/Cx型标准株4种常用抗菌药物阿奇霉素、米诺环素、莫西沙星、多西环素体外药物敏感性和31例临床标本包涵体数量的影响。2、探讨E型标准株和40例经细胞培养成功的沙眼衣原体E型临床株随着传代次数的增加其热休克蛋白60（HSP60）含量的改变及不同治疗效果患者首次传代碘染出现包涵体情况的差别。方法：在沙眼衣原体D、E型菌株接种于致密单层的McCoy细胞时,加入含有不同浓度PEG的细胞培养液,离心后在孵箱中静置2h后换成衣原体感染液,48h后固定,碘染计数包涵体数量。将经过0.7%PEG处理过的沙眼衣原体接种于细胞培养板的McCoy细胞,使McCoy细胞感染率达90%以上后进行药敏实验。采用微量稀释法测定体外4种抗菌药物对沙眼衣原体的作用并在细胞培养液中加入0.7%PEG,将31例衣原体细胞培养阳性且基因分型为D、E型的临床标本加入或者不加入0.7%PEG接种于致密单层的McCoy细胞后计数第一代全孔包涵体数量。将经McCoy细胞培养法检测出的40例E型沙眼衣原体临床株,通过RT-PCR方法检测首次传代,二次传代,三次传代和四次传代的CHSP60含量,将40例E型沙眼衣原体临床株分为首次传代出现和未出现包涵体两组,通过χ2检验不同治疗效果患者首次传代碘染出现包涵体情况的差别。结果：0.7%PEG能使沙眼衣原体E型标准株包涵体数量提高3.44倍,D型标准株包涵体数量提高3.56倍,为促进沙眼衣原体D、E型生长的最适浓度。在体外,PEG处理过的沙眼衣原体D、E型标准株的阿奇霉素、莫西沙星、多西环素、米诺环素的最低抑菌浓度与未经PEG处理的沙眼衣原体标准株药敏结果一致,0.7%PEG可以显著增加沙眼衣原体D、E型临床标本传代产生的包涵体数量。经细胞培养成功的E型沙眼衣原体临床株传代未出现包涵体时其CHSP60含量较出现包涵体时高（P<0.05）。首次传代出现包涵体与否其对应患者治疗效果有差别,治疗失败患者80%首次传代未出现包涵体,一个疗程治疗后转阴患者70%在首次传代出现包涵体。结论：1、0.7%的PEG可以显著促进沙眼衣原体D型、E型的生长并对沙眼衣原体D型、E型标准株药敏结果无明显影响,且可以进一步提高临床标本检测的敏感性。2、80%治疗失败患者首次传代未见包涵体,经过细胞培养成功但首次或者二次传代培养未出现包涵体的临床标本其对应患者感染的衣原体其合成CHSP60增加,二者提示衣原体可能处于一个持续性状态,出现包涵体可能标志着这种持续性状态的解除。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、聚乙二醇促进沙眼衣原体生长最适浓度的探讨
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 McCoy细胞培养
• 1.2.2 Ct直接免疫荧光检测
• 1.2.3 Ct菌株培养
• 1.2.4 不同浓度PEG作用下包涵体及细胞形态
• 1.2.5 不同浓度PEG对McCoy细胞代谢活性影响的MTT检测
• 1.2.6 不同浓度PEG作用下包涵体计数后计算的包涵体数量增加的倍数
• 1.2.7 MIC范围
• 1.3 讨论
• 1.3.1 沙眼衣原体临床株培养方法的改进
• 1.3.2 使用聚乙二醇促进沙眼衣原体的生长
• 1.4 小结
• 二、E型沙眼衣原体临床株热休克蛋白60含量随传代的变化
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 基因分型结果
• 2.2.2 沙眼衣原体不同临床标本培养时不同传代次数出现包涵体
• 2.2.3 质粒PCR结果
• 2.2.4 酶免疫结果
• 2.2.5 细胞中总RNA的提取结果
• 2.2.6 E型标准株,标本A不同传代次数CHSP60与16SrRNA电泳结果
• 2.2.7 标本B,C不同传代次数CHSP60与16SrRNA电泳结果
• 2.2.8 40例沙眼衣原体临床株CHSP60随传代的含量的变化
• 2.2.9 治疗失败患者和治疗后一个疗程衣原体检测即转阴的患者首次就诊采取标本的衣原体培养结果的差别
• 2.3 讨论
• 2.3.1 首次传代出现和未出现包涵体标本相对应患者治疗效果的比较的差别产生的可能原因
• 2.3.2 沙眼衣原体热休克蛋白60含量与沙眼衣原体首次细胞培养结果的关系
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢