论文摘要
目的马兜铃酸肾病（Arisolochic acid nephrapathy，AAN）是由于服用含有马兜铃酸（Arisolochic acid，AA）的中草药所致的急慢性间质肾病。临床上表现为急性肾衰，慢性肾衰和（或）肾小管酸中毒。肾脏病理主要表现为肾小管上皮细胞坏死、脱落、小管基底膜萎缩，间质大量单个核粒细胞浸润和（或）纤维化及微血管病变，血管壁增厚、管腔狭窄、甚至完全闭塞。近年来AAN受到国内外广泛关注，但目前对AAN的治疗尚无成熟方法。本实验目的是通过关木通水煎剂灌胃制备慢性马兜铃酸肾病（Chronic arisolochic acid nephrapathy，CAAN）大鼠模型，观察应用羟苯磺酸钙（安多明）治疗对CAAN大鼠24小时尿蛋白定量，血肌酐（Scr），血尿素氮（BUN）以及肾小管周毛细血管（PTC）内皮细胞特异抗原CD34和血管性假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）表达的影响。探讨羟苯磺酸钙改善CAAN大鼠模型肾脏微循环障碍的作用和机理。材料和方法一．实验材料1．实验动物雌性Wistar大鼠60只，周龄7～8周，体重190～220g。随机分为3组，每组20只。分为正常对照组，CAAN未治疗组，羟苯磺酸钙治疗组。2．主要试剂和药品中药关木通、羟苯磺酸钙（安多明）、Masson试剂盒、兔抗大鼠CD34多克隆抗体免疫组化试剂盒、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒、兔抗大鼠vWF多克隆抗体免疫组化试剂盒、生物素化羊抗兔IgG。3．主要仪器光学显微镜，显微照像仪，显微图象分析仪，分光光度计，离心机，全自动生化分析仪。二．实验方法1．关木通水煎剂配制方法取关木通生药材2000g，加6倍饮用水，浸泡30分钟，加热至沸，煎煮30分钟，倾出药液，残渣再加入4倍饮用水，煎煮30分钟，合并两次药液，过滤，浓缩后制成1000ml水煎剂（相当于2g生药/ml），4℃放置备用。2．实验动物分组及给药方法将Wistar大鼠随机分3组，每组20只均经口灌胃。（1）对照组：饮用水灌胃16周，剂量10 ml/（kg．d），分两次灌胃。（2）未治疗组：关木通水煎剂灌胃12周，剂量20g/（kg．d）相当于10ml/（kg．d），再予饮用水灌胃4周，剂量10ml/（kg．d），分两次灌胃。（3）治疗组：关木通水煎剂灌胃12周剂量、方法同未治疗组，再予羟苯磺酸钙灌胃4周，剂量100mg/（kg．d）（100mg溶于10ml饮用水），分两次灌胃。实验期间大鼠均自由饮食，饮水。3．尿蛋白及肾功检测在第12周，16周分别将大鼠放入代谢笼中收集24小时尿液，记24小时尿量，采用磺柳酸—硫酸钠比浊法测尿蛋白。收集尿液后用10％水合氯醛腹腔麻醉大鼠，剖开腹腔，下腔静脉采血，测血尿素氮（BUN），血肌酐（SCr）。取肾组织，置于4％多聚甲醛备用。4．肾组织形态学检查肾组织标本用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE和Masson常规染色，普通光镜观察。5．免疫组织化学结果分析按ABC法进行免疫组织化学染色，DAB显色。用显微照像仪照像，用显微图象分析仪对图像进行定量分析。每张切片随机选取5个高倍视野（400倍），测定其阳性染色物质积分光密度（Intergrated optical density，IOD）值。6．统计学方法计量数据用均数±标准差表示，两组间均数比较，应用t检验，组间差异比较采用t检验，用统计软件SPSS13.0分析处理。结果1．尿蛋白及肾功检测关木通水煎剂灌胃12周，未治疗组和治疗组大鼠24小时尿蛋白定量，血清尿素氮，血肌酐升高，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。第16周，未治疗组24小时尿蛋白定量为（63.56±12.7）mg/24h，BUN为（17.38±2.72）mmol/L，Scr为（83.5±9.91）umol/L；治疗组24小时尿蛋白定量减少为（35.58±3.88）mg/24h，BUN下降为（13.8±2.38）mmol/L，Scr下降为（66.75±8.45）umol/L，与未治疗组比较差异有统计学意义（P<0.01）。2．病理检测第16周Masson染色，未治疗组间质纤维化区域积分光密度值为（69.97±17.69）×103，治疗组大鼠肾间质纤维化减轻，间质纤维化区域积分光密度值为（38.22±5.17）×103，与未治疗组比较差异有统计学意义（P<0.01）。3．免疫组织化学结果3．1 CD34结果：第16周，与未治疗组比较，治疗组大鼠CD34阳性表达增加，未治疗组CD34+-IOD值为（3.19±1.4）×103，治疗组CD34+-IOD值为（16.7±4.2）×103。两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。3．2 vWF结果：第16周，与未治疗组比较，治疗组大鼠vWF阳性表达减少，未治疗组vWF+-IOD值为（18.66±4.65）×103，治疗组vWF+-IOD值为（10.16±1.68）×103。两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论1．羟苯磺酸钙治疗能减少CAAN大鼠尿蛋白的排泄，改善肾功能。2．羟苯磺酸钙治疗能减轻CAAN大鼠肾间质纤维化。3．羟苯磺酸钙治疗能增加CAAN大鼠肾组织CD34+细胞的表达，增加肾小管周围毛细血管密度；羟苯磺酸钙能减少CAAN大鼠肾组织vWF+细胞的表达，减少微血栓形成。