Cdt1结合结构域与Mcm6结合结构域的NMR结构研究

论文摘要

本论文包含两部分：1)在真核细胞中,DNA的复制受到严格的控制,以保证在每个细胞周期中DNA准确的复制一次。DNA复制的起始阶段是复制过程中关键的一步,该过程受复制前复合物（pre-replication complex, pre-RC）的严格控制。微小染色体维持蛋白（minichromsome maintenance, MCM）复合物是pre-RC的重要组分,该复合物是由同一家族结构相类似的6个亚单位（Mcm2-Mcm7）组成,目前被认为是DNA复制过程中的解链酶,并在复制叉的延伸过程中起关键作用。在细胞周期的M晚期和G1早期,Mcm2-7复合物依赖于另一个pre-RC的重要亚单位Cdc10依赖性转录因子（Cdc10 dependent transcriptl, Cdt1）而结合到染色质上面。Mcm6是Mcm2-7复合物中的一个亚单位,由位于蛋白中部高度保守的MCM结构域和C-末端尚未被研究的结构域构成。本文研究表明,高度保守的Mcm6 C-末端能够与Cdtl相互作用,并将与Cdtl相互作用的区域称为Cdtl结合结构域（Cdt1 binding domain, CBD）,并通过高分辨率核磁共振方法解析出其空间结构。CBD的结构为典型的"winged-helix"折叠。"winged-helix"折叠通常参与蛋白质-核酸的相互作用,但本文的研究发现CBD同DNA没有直接相互作用,表明CBD特异性的参与蛋白质—蛋白质之间的相互作用。同时我们也发现了位于Cdtl上面与Mcm6相结合的区域（Mcm6 binding domain, MBD）。利用核磁共振滴定实验,我们确认出位于CBD上面直接与Cdtl相互作用的氨基酸,E757和L766,通过生物化学以及细胞学实验验证了这两个氨基酸在Mcm6-Cdtl相互结合中的关键作用。同时,通过高分辨率核磁共振方法解析了MBD的溶液结构为α螺旋,利用核磁共振滴定实验确定了MBD上与CBD的相互结合区域。通过13C-edited （F1）, 13C/15N-filtered （F3）3DNOESY观测到了CBD与MBD分子间的NOE,解析出CBD-MBD复合物结构。确定了CBD与MBD结构域相互作用的区域和重要氨基酸,阐述了CBD与MBD通过HTH结构基元相互识别的特异性。我们认为,Mcm6通过其CBD与Cdtl的MBD相互作用可能引起Mcm2-7复合物与染色质相结合而完成pre-RC的装配,本文的研究工作为深入理解DNA的复制起始机理提供了重要结构依据。2) SWIRM结构域是在许多染色质修饰与重塑蛋白质分子中存在的一个非常保守的模块,比在如染色质修饰复合物中的LSDl和Ada2蛋白质分子中都存在有SWIRM结构域。本文通过NMR方法解析了LSDl中SWIRM结构域的溶液结构并与已经发表的包含有同样序列的晶体和NMR结构相比较发现,N-末端的十个氨基酸并未如已发表的结构一样形成α螺旋,而是呈现出无规卷曲结构。因此,将N末端序列延长5个氨基酸,通过2D 1H-15N-HSQC谱以及异核1H-15N NOE实验研究发现,这五个氨基酸对α螺旋的形成和稳定起到了重要作用。

论文目录

• 论文摘要
• Abstract
• 第一章 蛋白质分子溶液结构核磁共振方法概述
• 1.1 样品制备
• 1.2 核磁共振实验
• 1.2.1 NMR基本原理
• 1.2.2 NMR仪器
• 1.2.3 NMR的基本实验参数
• 1.2.3.1 化学位移
• 1.2.3.2 自旋耦合
• 1.2.3.3 弛豫参数,T1,T2,NOE
• 1.2.4 多维NMR实验的基本概念
• 1.2.5 蛋白质的NMR实验及解析策略
• 1.2.5.1 同核实验
• 1.2.5.2 异核多维实验
• 1.2.5.3 解析策略
• 1.2.6 突破分子量上限的TROSY和CRINEP
• 1.2.6.1 TROSY
• 1.2.6.2 CRINEPT
• 1.2.7 RD NMR及GFT NMR实验技术
• 1.3 数据处理
• 1.4 结构计算
• 1.4.1 距离约束
• 1.4.2 二面角约束
• 1.4.3 残留偶极偶合（RDC）
• 1.4.4 计算方法
• 第二章 溶液中CBD（hCdt1 binding domain of hMcm6）结构域的NMR结构
• 2.1 前言
• 2.1.1 DNA复制与细胞周期介绍
• 2.1.2 Cdt1与Mcm6相互作用研究概述
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品制备
• 2.2.2 NMR实验
• 2.2.3 数据处理
• 2.2.4 数据谱处理
• 2.2.5 结构计算
• 2.2.6 CBD结构域与Cdt1平衡常数的测定
• 2.3 结论
• 2.3.1 溶液条件优化
• 2.3.2 CBD序列指认与结构计算
• 2.3.3 结构描述
• 2.3.4 CBD与MBD相互作用的研究
• 2.3.5 讨论
• 第三章 溶液中CBD结构域与MBD结构域复合物NMR结构研究
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 样品制备
• 3.1.2 NMR实验
• 3.1.3 数据处理
• 3.1.4 数据谱处理
• 3.1.5 结构计算
• 3.1.6 MBD结构域与CBD结构域NMR滴定实验
• 3.2 结论
• 3.2.1 MBD结构域NMR研究
• 3.2.2 MBD结构域与CBD结构域相互作用NMR研究
• 3.2.3 MBD结构域与CBD结构域复合物NMR结构
• 3.2.4 讨论
• 第四章 溶液中SWIRM结构域的NMR结构
• 4.1 实验
• 4.1.1 质粒的构建
• 4.1.2 蛋白质表达
• 4.1.3 纯化
• 4.1.4 NMR实验
• 4.1.5 数据处理
• 4.1.6 数据谱处理
• 4.1.7 结构计算
• 4.1.8 NMR动力学实验
• 4.2 结论
• 4.3 总结
• 附录
• 本文缩写词及英汉对照
• 二十种氨基酸名称及缩写
• 参考文献
• 攻读学位期间发表和待发表的论文
• 致谢