联用色谱在中药活性成分和生物样品分析中的应用研究

论文摘要

近年来,“回归自然”的浪潮使中药备受关注,中药现代化的步伐越来越快。中药现代化进程中主要面临着两方面的问题:①中药成分复杂,并且成分之间相互影响和作用,同一成分化合物的分析结果可能会因母体药材或制剂配方的改变而受到不同程度的影响。故建立简单、可靠的中药及其复方中活性成分的分析方法是实现中药现代化的基本前提之一。②中药的有效成分是新药开发的先导,但是中药的药效成分与生物体内的代谢作用机理还不是十分清晰,因此建立灵敏、准确、快速生物样品中中药活性成分的测定分析方法,为进一步实现中药药代动力学的研究就显得尤为迫切。联用色谱技术的发展为中药的质量控制研究和中药药效物质基础研究提供了一个高效、可靠的分析方法。基于此,本文主要开展了以下几方面的创新性研究工作:（1）采用分子印迹技术,以表儿茶素作为模板分子,丙烯酰胺为功能单体,乙烯基二甲基丙烯酸酯为交联剂,合成了表儿茶素分子印迹聚合物。用红外光谱和扫描电子显微镜表征了所合成的分子印迹聚合物。通过筛分,粒子尺寸在15和38μm之间的分子印迹聚合物被选为固相萃取吸附剂。结果表明:分子印迹聚合物对表儿茶素具有较高的分子识别能力和选择性。而空白聚合物却不具备这样的特性。在此基础上,把此分子印迹聚合物固相萃取小柱用于萃取茶叶提取物,分离富集其中的活性成分单体表儿茶素,获得了满意的结果。（2）我们选取了栀子中的主要生物活性物质栀子甙为目标分析物,建立了用于分析栀子和栀子中药制剂清火栀麦片中的栀子甙的高效液相色谱-二极管阵列-质谱联用（HPLC-DAD-ESI/MS）分析方法。为了进一步更全面的对栀子中药制剂清火栀麦片进行质量控制,针对现有分析栀子中药制剂的缺陷,发展了简便、灵敏的高效液相色谱-二极管阵列-质谱联用（HPLC-DAD-ESI/MS）方法同时分析中药栀子复方制剂清火栀麦片及其原料药材中的活性物质脱水穿心莲内酯,穿心莲内酯和栀子甙。这三种活性成分主要用来作为清火栀麦片的质量控制的标志物。相对于其他分析方法,此方法提供了更多的定性、定量信息,同时能更全面的对中药复方制剂进行质量控制。（3）针对现有的流动相体系不能对橘属中药中生物碱类和黄酮类两种不同色谱保留行为的活性物质同时分析测定的现状,且对生物碱类分析的流动相不适合于液质联用分析,我们采用挥发性全氟羧酸为离子对添加剂,解决了生物碱类物质辛氟林的低保留和峰拖尾,并考察了对黄酮类物质的色谱保留行为的影响,首次成功地建立了橘属中药中生物碱类和黄酮类物质同时分析的高效液相色谱-二极管阵列-质谱联用（HPLC-DAD-ESI/MS）分析方法。并且把这种方法应用于橘属中药青皮、陈皮、枳实和枳壳的全面质量控制中,获得满意的结果。（4）以中药人参中的大分子量活性化合物人参皂甙为研究对象,研究了高锥孔电压对其电离效率,检测灵敏度的影响。建立了简单、灵敏的分析人参皂甙的高效液相色谱-质谱联用分析方法。高锥孔电压的采用能大大提高检测灵敏度,并且得到用于人参皂甙结构鉴定的加合离子和特征碎片离子。分析方法的线性范围在5-2×105之间,线性相关系数超过0.990,检测限达到pg级。该方法成功地应用于人参以及人参制剂中的人参皂甙的分析检测中,为其质量控制提供了更为简单、有效的检测方法。（5）在本章中,建立了磁性纳米粒子-微波萃取的新方法用于中药中的有效成分的提取。这种新方法基于磁性纳米粒子能够吸收辐射的微波,把磁性纳米粒子作为中间媒介吸收微波。以中药黄芩的有效成分提取为例,磁性纳米粒子-微波萃取整个的萃取过程只需要40 s的微波辐射时间。而且,与一般的微波萃取相比,加入磁性纳米粒子的萃取效率更高,需要的有机溶剂更少。得到的提取物用高效液相色谱-质谱联用分析。本文所建立的方法的回收率在97.6–104.1%之间,相对标准偏差小于2.5%。黄芩苷,黄芩素,汉黄芩素的检测限分别为0.05,1.0和2.0 ng/mL。此方法成功地应用到了实际样品中有效成分地提取分析检测。（6）为了保护动物,减少或取代动物实验,体外评估化学药品对细胞的毒性作用对于开发新药用于治疗各种各样的癌症具有十分重要的作用。尽管伊立替康对白血病、消化道和卵巢肿瘤具有较好的治疗作用,而对乳腺癌治疗的报道很少。本文首次以乳腺癌细胞MCF-7为模型,体外评估了伊立替康对乳腺癌细胞的毒性后,建立了快速、简单的HPLC-ESI/MS测定细胞中伊立替康及其代谢产物SN-38的方法,本法采用-80℃甲醇一步沉淀蛋白,线性范围可达3个数量级,线性相关系数大于0.9995,且方法特异性高,基质效应小,具有合适的精密度和灵敏度。该法成功地测定了伊立替康作用不同时间下的MCF-7细胞内的药物浓度,对抗肿瘤药物伊立替康的细胞药物代谢动力学进行了初浅地探讨。（7）样品制备在HPLC的生物样品分析中是关键性的一步,经典的样品预处理包括蛋白质沉淀和药物萃取。此方法的缺点是大大增加了劳动量和分析时间,同时由于分析物在沉积蛋白质上的吸附而降低了回收率。直接进样技术在节约时间和劳力方面显示出了相当大的优越性。本工作应用简单、可靠的胶束液相色谱（micellar liquid chromatography ,MLC）法直接进样分析了生物样品中的隐丹参酮和丹参酮ⅡA。隐丹参酮和丹参酮ⅡA是传统中药丹参中主要的活性成分。由于它们有活跃的强而广药理性质,受到广泛关注。在实验中,采用C18色谱柱,流动相是pH 5的0.15 M SDS-8%正丁醇（n-butanol）溶液。与高有机溶剂消耗的HPLC相比,更为绿色。该方法准确度、精确度好、回收率高。并且也能成功地应用到丹参制剂中的隐丹参酮和丹参酮ⅡA分析检测,为丹参及其制剂中活性成分的药理,药代动力学研究研究提供了简单可靠的分析检测方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 中药的发展现状
• 1.2 中药及中药复方质量控制
• 1.3 生物样品中中药活性成分的研究意义
• 1.4 新提取技术提升中药有效成分的研究
• 1.4.1 超声萃取（Ultrasonic Extraction，UE）
• 1.4.2 超临界流体萃取技术（supercritical fluid extraction，SFE）
• 1.4.3 分子印迹分离技术
• 1.4.4 顶空固相微萃取（HS-SPME）与顶空液相微萃取（HS-LPME）
• 1.4.5 微波辅助萃取（Microwave-Assisted Extraction, MAE）
• 1.4.6 加压液体萃取（Pressurized-liquid extraction，PLE）
• 1.4.7 微波蒸馏（Microwave distillation，MD）
• 1.5 液相色谱及其联用技术在中药研究中的应用
• 1.5.1 高效液相色谱技术历史
• 1.5.2 高效液相色谱柱的进展
• 1.5.3 液相色谱/紫外-二极管阵列检测（LC/UV-DAD ）联用
• 1.5.4 液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD） 联用
• 1.5.5 液质（HPLC-MS） 联用
• 1.6 本文的研究思路和内容
• 第一部分 中药及其制剂中活性成分的联用色谱分析
• 第2章 分子印迹固相萃取-色谱联用分析用于茶叶中表儿茶素的测定
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 标准溶液配制
• 2.2.4 分子印迹聚合物（MIP）的制备
• 2.2.5 分子印迹-固相萃取
• 2.2.6 色谱分析
• 2.2.7 样品预处理
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 MIP 的物理化学表征
• 2.3.2 聚合物颗粒大小对吸附能力的影响
• 2.3.3 溶剂对 MIP 键合能力的影响
• 2.3.4 萃取小柱的印迹能力
• 2.3.5 MIP 的选择性吸附能力
• 2.3.6 实际样品分析
• 2.4 小结
• 第3章 高效液相色谱－二极管阵列－质谱联用技术用于栀子及其制剂的分析
• 3.1 栀子以及栀子制剂中栀子甙的分析
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 实验部分
• 3.1.3 结果和讨论
• 3.1.4 小结
• 3.2 栀子制剂中多种活性目标物的分析
• 3.2.1 引言
• 3.2.2 实验部分
• 3.2.3 结果和讨论
• 3.2.4 小结
• 第4章 微波萃取－高效液相色谱－二极管阵列－质谱联用技术用于中药中黄酮类和生物碱类化合物同时测定
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 材料与试剂
• 4.2.2 仪器
• 4.2.3 标准溶液配制
• 4.2.4 微波萃取
• 4.2.5 HPLC-DAD-ESI/MS 分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 高效液相色谱条件的优化
• 4.3.2 质谱条件的优化
• 4.3.3 全氟羧酸添加剂以及乙腈对分析物离子强度的影响
• 4.3.4 辛弗林，柚皮甙和橙皮甙的质谱分析
• 4.3.5 微波助提实验条件的优化
• 4.4 方法确证
• 4.4.1 线性关系以及检测限
• 4.4.2 精密度
• 4.4.3 回收率
• 4.5 样品分析
• 4.6 小结
• 第5章 液相色谱－高锥孔电压质谱技术用于人参中人参皂甙的快速灵敏分析
• 5.1 引言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 仪器
• 5.2.3 标准溶液配制
• 5.2.4 人参样品制备
• 5.2.5 HPLC-ESI/MS 分析
• 5.3 结果和讨论
• 5.3.1 ESI 正离子模式下采用高锥孔电压的优势
• 5.3.2 锥孔电压对灵敏度的影响
• 5.3.3 液质联用对人参皂甙标准品的分析
• 5.4 方法确证
• 5.4.1 线性关系和检测限
• 5.4.2 精密度
• 5.4.3 回收率
• 5.5 样品分析
• 5.6 小结
• 第6章 新型磁性纳米粒子－微波萃取－液质联用技术用于中药及中药制剂中的活性成分分析
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 实验试剂
• 6.2.2 实验仪器
• 6.2.3 标准溶液
• 6.2.4 HPLC-ESI/MS 分析
• 6.2.5 磁性纳米粒子的合成
• 6.2.6 MBMAE 萃取
• 6.2.7 热回流萃取
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 色谱条件的优化
• 6.3.2 质谱条件的优化
• 6.3.3 验证加入磁性纳米粒子的可行性
• 6.3.4 MBMAE 条件的优化
• 6.3.5 黄芩中活性成分的鉴定
• 6.4 方法确证
• 6.4.1 线性关系以及检测限
• 6.4.2 重现性
• 6.4.3 回收率
• 6.5 MBMAE 方法与热回流的比较
• 6.6 实际样品分析
• 6.7 小结
• 第二部分 生物样品的联用色谱分析
• 第7章 细胞环境中抗肿瘤药物（伊立替康）的液质联用测定
• 7.1 引言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 材料与试剂
• 7.2.2 仪器
• 7.2.3 细胞培养及细胞处理
• 7.2.4 溶液的配制
• 7.2.5 HPLC-ESI/MS 分析
• 7.3 结果和讨论
• 7.3.1 色谱分离条件的优化
• 7.3.2 质谱条件的选择
• 7.3.3 样品制备方法优化
• 7.3.4 方法验证
• 7.3.5 细胞毒性实验
• 7.3.6 MCF-7 细胞中抗肿瘤药物的测定
• 7.4 小结
• 第8章 尿液、血清中丹参活性成分的胶束液相色谱法直接测定
• 8.1 引言
• 8.2 实验部分
• 8.2.1 材料与试剂
• 8.2.2 仪器
• 8.2.3 溶液配制
• 8.2.4 血浆和尿液样品的处理
• 8.2.5 中药制剂预处理
• 8.2.6 色谱条件
• 8.3 结果与讨论
• 8.3.1 流动相的优化
• 8.3.2 方法的验证
• 8.4 实际样品分析
• 8.5 胶束液相色谱（MLC）和水－有机相反相液相色谱方法的比较
• 8.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢