福建稻田细菌群落PCR-DGGE分析和石油烃降解基因克隆

论文摘要

在稻田生态系统中,稻田土壤微生物参与稻田土壤肥力的形成,植物营养的转化,它们能预测土壤有机质的变化,可以作为衡量土壤肥力高低的重要指标。对稻田土壤细菌群落的研究可以为调整稻田耕作、施肥制度、提高土壤肥力提供理论依据。本研究用不依赖细菌培养的16S rDNA-PCR-DGGE方法对福建省六个不同地区12个取样点的稻田土壤进行细菌群落结构分析。直接提取12份样品的总DNA,用F341GC/R534引物扩增16S rDNA基因的V3可变区,结合DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）技术分析样品细菌群落组成。结果表明,福建省不同地区的稻田土壤之间细菌群落结构存在较大差异,大体上可分为闽东、闽南、闽北、闽西四个大类。同一地区的根际土和表土样品之间也存在差异,但差异相对较低,其中龙岩根际土和表土细菌群落结构相似性最大,永泰差异性最大。回收了DGGE图谱中11个条带,测序结果经过Blast比对表明其中10个条带代表的细菌是不可培养的,显示了DGGE技术的优越性。石油在给人们带来巨大经济利益的同时,也对环境造成了污染,环境中广泛存在的石油烃污染物对人体健康和生态系统的安全构成了很大威胁。石油烃污染成为目前全球普遍关注的焦点问题。现有的石油污染处理方式包括物理技术、化学技术和生物修复等。其中,生物修复具有明显优势,生物修复中的微生物治理由于其费用低、效果好、无二次污染等优点,而成为一种最有发展潜力的治理石油烃污染的技本。微生物修复首要的是石油烃降解菌株的获得及降解条件的确定。本研究以石油专性培养基,从未被污染的稻田土壤中分离、筛选到4株能在石油为唯一碳源的分离物。并扩增了可降解石油烃的关键基因alkB和C23O。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 传统的微生物培养法
• 1.2 生物标记法（biomarker）
• 1.3 BIOLOG鉴定系统
• 1.4 分子生物学方法
• 1.4.1 荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, FISH）
• 1.4.2 单链构象多态性（Single-Stranded-Conformation Polymorphism, SSCP）
• 1.4.3 16S rDNA的限制性片段长度多态性（RFLP）分析（ARDRA）
• 1.4.4 16S rDNA末端标记限制性片段长度多态性分析（T-RFLPs）
• 1.4.5 随机扩增片段多态性 DNA（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）
• 1.4.6 变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）
• 1.5 PCR-DGGE
• 1.5.1 原理
• 1.5.2 应用
• 1.5.3 DGGE技术的优缺点
• 1.6 石油污染治理
• 1.6.1 土壤石油污染的处理方法
• 1.6.2 降解石油烃的微生物种类
• 1.6.3 微生物对石油烃的降解机理
• 1.6.4 影响石油生物降解的因素
• 2. 福建省稻田土壤细菌群落的16S rDNA-PCR-DGGE分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 土壤样品
• 2.1.2 试剂以及仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 土壤理化指标测定
• 2.2.2 土壤总 DNA的提取（SDS-based法）
• 2.2.3 土壤 DNA的纯化
• 2.2.4 对土壤总 DNA进行16S rDNA基因的套式 PCR扩增
• 2.2.5 套式 PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 2.2.6 变性梯度凝胶电泳（DGGE）后的特异条带分析
• 2.2.7 变性梯度凝胶电泳谱带的回收测序
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 土壤样品理化性质测定
• 2.3.2 SDS法提取稻田土壤总DNA
• 2.3.3 DNA纯化
• 2.3.4 PCR扩增
• 2.3.5 变性梯度凝胶电泳
• 3、石油烃降解菌株筛选
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.1.3 菌种来源
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌株的分离筛选
• 3.2.2 细菌分离物分子生物学分析
• 3.2.3. PCR产物的克隆测序
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 石油烃降解菌的分离、筛选
• 3.3.2 具石油烃降解功能的细菌分离物的DNA提取
• 3.3.3 16SrDNA PCR-DGGE
• 3.3.4 石油烃降解关键基因扩增
• 3.3.5 序列测定
• 3.4 菌株 B9、B12、E47、G22研究
• 4. 讨论
• 4.1 福建稻田土壤细菌群体结构的DGGE分析
• 4.2 关于降解石油烃基因的克隆与相关菌株筛选
• 4.3 PCR-DGGE的相关技术探讨
• 5. 结语
• 参考文献
• 附录
• 致谢