抑制ras原癌基因药物的筛选和第二代药物筛选试剂盒的构建

论文摘要

目前人们普遍利用小鼠作为模式生物来筛选抗癌药物,但是却面临着高费用,长周期的弊端；利用生化反应,体外培养细胞或者细菌/酵母的抗癌药物研究往往效率高但是体内外活性相关性差,尤其是当药物在体内的作用靶点不止一个时,整体动物试验往往能提供更准确的评估。而利用秀丽隐杆线虫为模式生物就可以部分解决上述弊端。秀丽隐杆线虫体内let-60基因与人类的ras基因为同源基因,而大约30%的人类肿瘤均存在ras基因的突变过度激活及RAS蛋白表达水平增高,在以细胞信号转导通路为靶点的抗肿瘤药物设计中,调控Ras信号转导途径起着重要作用。本项目利用ras基因突变的秀丽隐杆线虫MT2124株系作为模式生物,首先利用实验室研制的第一代药物筛选试剂盒筛选了莪术醇,丹参酮ⅡA磺酸钠,丹皮酚,实验显示它们确实对RAS-MAPK通路过度激活有一定的下调作用,丹参酮ⅡA磺酸钠最好的效果可以使线虫群体中野生型线虫所占比例从32%增加到66%,而莪术醇可以使线虫群体中的野生型线虫所占比例从21%增加到63%。在上述研究基础上,本论文构建了第二代药物筛选试剂盒,第二代试剂盒的原理是利用荧光染料A对秀丽隐杆线虫进行染色,然后利用荧光酶标仪进行检测,精确测量了不同数目秀丽隐杆线虫群体的荧光值差异、野生型比例不同的秀丽隐杆线虫的荧光值差异以及不同浓度A染料对线虫群体染色后荧光值的差异,制备出高通量的第二代药物筛选试剂盒,利用阳性药物依托泊苷和索拉菲尼证实了第二代药物筛选试剂盒的可靠性。第二代药物筛选试剂盒获得的数据比第一代更精确,而且操作简单,节省人力,不需要进行专业训练,有利于试剂盒的推广利用,并通过第二代药物筛选试剂盒筛选莪术醇和雄黄浸出液复方下调ras原癌基因过度激活的效果。

论文目录

• 目录
• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1 抗癌药物研究现状
• 1.1 化学药物
• 1.2 天然药物
• 1.3 生物制药
• 2 传统常用抗癌药物筛选模型
• 2.1 人癌裸鼠移植模型
• 2.2 人癌小鼠肾包膜下（SRC）移植模型
• 2.3 离体癌细胞培养
• 3 以秀丽隐杆线虫为模式生物进行药物筛选的研究进展
• 3.1 秀丽隐杆线虫简介及其秀丽隐杆线虫药物筛选模型
• 3.2 秀丽隐杆线虫作为药物筛选模型的优势
• 3.2.1 秀丽隐杆线虫作为药物筛选模型的遗传学优势
• 3.2.2 用整体生物进行中药复方的筛选的优势
• 3.2.3 秀丽隐杆线虫与其它模式生物相比的优势
• 3.3 秀丽隐杆线虫抗癌药物筛选的研究进展
• 4 秀丽隐杆线虫药物筛选试剂盒及其研究现状
• 5 立论依据
• 第二部分 利用第一代抗癌药物筛选试剂盒筛选药物
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 秀丽隐杆线虫
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌体的培养
• 1.2.2 秀丽隐杆线虫的同步化
• 1.2.3 莪术醇的溶液的配置
• 1.2.4 丹参酮Ⅱ A磺酸钠,莪术醇,丹皮酚溶液下调ras基因过度激活的研究
• 2 实验结果和分析
• 2.1 丹参酮Ⅱ A磺酸钠溶液下调ras基因过度激活效果
• 2.2 莪术醇溶液下调ras基因过度激活效果
• 2.3 丹皮酚溶液下调ras基因过度激活效果
• 3 讨论
• 第三部分 第二代药物筛选试剂盒的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 秀丽隐杆线虫
• 1.1.4 染料
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌体的培养
• 1.1.2 秀丽隐杆线虫的同步化
• 1.2.3 秀丽隐杆线虫的染色
• 1.2.4 秀丽隐杆线虫用荧光染料A染色后荧光值的检测
• 1.2.5 数目不同的线虫群体荧光染料A染色后荧光值检测
• 1.2.6 线虫群体用不同浓度荧光染料A染色后荧光值检测
• 1.2.7 野生型比例不同的线虫群体荧光染料A染色后荧光值检测
• 2 实验结果
• 2.1 秀丽隐杆线虫的荧光染料A染色
• 2.3 线虫群体用不同浓度荧光染料A染色1h的荧光值
• 2.4 线虫群体用不同浓度荧光染料A染色后荧光值随时间的变化
• 2.5 野生型比例不同的线虫群体荧光染料A染色的荧光值
• 3 讨论
• 第四部分 第二代药物筛选试剂盒的验证及其应用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 培养基
• 1.1.2 菌种
• 1.1.3 秀丽隐杆线虫
• 1.1.4 染料
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌体的培养
• 1.2.2 雄黄浸出液的制备
• 1.2.3 第一代药物筛选试剂盒筛选雄黄浸出液的研究
• 1.2.4 第二代药物筛选试剂盒的可靠性
• 1.2.6 利用第二代药物筛选试剂盒筛选具有抗肿瘤药效的中药复方
• 2 实验结果与分析
• 2.1 雄黄浸出液验证第二代药物筛选试剂盒结果
• 2.1.1 第一代药物筛选试剂盒筛选雄黄浸出液效果
• 2.1.2 雄黄浸出液验证第二代药物筛选试剂盒效果
• 2.2 依托泊苷验证验证第二代药物筛选试剂盒效果
• 2.3 索拉菲尼验证验证第二代药物筛选试剂盒效果
• 2.4 第二代药物筛选试剂盒筛选具有抗肿瘤药效的中药复方结果
• 3 讨论
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 致谢