噬菌体展示技术筛选幽门螺旋杆菌单链抗体的研究

论文摘要

幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,H. pylori）于1983年由澳大利亚学者Warren和Marshall从慢性胃炎患者胃粘膜中成功分离出。H. pylori是一种革兰氏阴性螺旋状杆菌,在胃上皮细胞定居繁殖。大量研究证实,H. pylori是慢性胃炎、消化性溃疡及胃肠道淋巴瘤的主要致病因素,并与胃癌发生密切相关。1994年国际癌症研究中心（IARC）将H. pylori列为I类致癌因子。由于目前治疗消化性溃疡三联治疗法存在着很多不足,因此能获得针对H. pylori的特异性抗体成为现在众多学者研究的热点。本文主要采用噬菌体展示技术首次从人源单链抗体文库Tomlinson I + J中用细胞筛选法筛选抗H. pylori的抗体。直接用H. pylori细胞固定进行五轮筛选,通过ELISA检测,第四轮筛选得到的含有单链抗体噬菌体在显色值达到最高,为阴性对照的4倍;随后,从随机挑选的96个克隆中获得了1株阳性克隆。再分别将阳性克隆与10种常见菌进行ELISA的交叉反应,最终得到1株含H. pylori的人源性单链抗体的噬菌体JH1。随后又进一步对JH1所表达的scFv基因进行PCR扩增,分别得到scFv的VH片段、VL片段和全长基因分别为527 bp、368 bp和935 bp,这些包含着部分载体序列的DNA片段与理论值相符。通过对人源性单链抗体全基因进行测序,在NCBI中进行基因序列比对,与已报道的一种植物RNA病毒的复制酶单链抗体基因序列有96%同源性。将阳性克隆JH1转入E.coli HB2151中进行分泌表达,并对表达产物进行ELISA检测,JH1在A540/A630的吸光值的比值远远高于作为空白对照的PBS或混合菌。这些证明scFv蛋白能够与H. pylori细胞特异性结合。之后,对表达后的大肠杆菌细胞通过反复冻融的方法进行破碎,我们采用亲和层析的方法对细胞破碎液进行纯化,通过SDS-PAGE电泳分析,在电泳图上获得一条纯化后的单一条带。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 幽门螺旋杆菌的发现及意义
• 1.1.1 幽门螺旋杆菌的发现
• 1.1.2 幽门螺旋杆菌发现的意义
• 1.2 幽门螺旋杆菌的特性
• 1.2.1 幽门螺旋杆菌的形态学特征
• 1.2.2 幽门螺旋杆菌的生理学和分子生物学特征
• 1.3 幽门螺旋杆菌的致病机制
• 1.3.1 H. pylori 的毒力因子
• 1.3.2 H. pylori 的黏附与定植
• 1.3.3 H. pylori 菌株
• 1.3.4 H. pylori 感染与炎症损伤
• 1.4 幽门螺旋杆菌的诊断方法
• 1.4.1 侵入性方法
• 1.4.2 非侵入性方法
• 1.5 幽门螺旋杆菌相关疾病的治疗
• 1.5.1 抗菌治疗
• 1.5.2 抗氧化剂治疗
• 1.6 噬菌体展示技术
• 1.6.1 噬菌体表面展示技术的原理与方法
• 1.6.2 噬菌体抗体库淘洗富集的原理与方法
• 1.6.3 噬菌体展示技术在幽门螺旋杆菌研究中的应用
• 1.6.4 噬菌体展示技术的意义
• 1.7 基因工程抗体
• 2、Fv'>1.7.1 小分子抗体scFv，Fab，F（ab’）²、Fv
• 1.7.2 小分子抗体特点及意义
• 1.7.3 单链抗体的构建
• 1.7.4 单链抗体的表达载体
• 1.7.5 单链抗体的可溶性表达
• 1.7.6 基因工程抗体的应用展望
• 1.8 立题背景
• 1.9 研究内容
• 第二章 幽门螺旋杆菌单链抗体的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌株与文库
• 2.2.2 实验主要试剂
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 培养基、溶液的配制及灭菌方法
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 幽门螺旋杆菌的培养
• 2.3.2 Tomlinson 文库的扩增以及滴度的测定
• 2.3.3 Tomlinson 文库的保存
• 2.3.4 KM13 辅助噬菌体的制备
• 2.3.5 空白细胞菌株的培养
• 2.3.6 噬菌体侵染E.coli TG1 最适侵染条件的摸索
• 2.3.7 幽门螺旋杆菌scFv 的筛选
• 2.3.8 单克隆scFv 的挑选
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 幽门螺旋杆菌的培养
• 2.4.2 Tomlinson 文库和KM13 辅助噬菌体滴度的测定
• 2.4.3 噬菌体侵染E.coli TG1 最适侵染条件
• 2.4.4 幽门螺旋杆菌scFv 的筛选
• 2.5 本章小结
• 第三章 幽门螺旋杆菌单链抗体的鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株与文库
• 3.2.2 实验主要试剂
• 3.2.3 实验仪器
• 3.2.4 培养基、溶液的配制及灭菌
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 幽门螺旋杆菌固定条件的摸索
• 3.3.2 Tomlinson 文库每轮筛选结果的ELISA 检测
• 3.3.3 单克隆scFv 的ELISA 检测
• 3.3.4 测定阳性克隆交叉反应
• 3.3.5 阳性克隆的scFv 基因的PCR 鉴定
• 3.3.6 阳性克隆PIT2 质粒的酶切分析
• 3.3.7 阳性克隆scFv 基因测序
• 3.4 实验结果与分析
• 3.4.1 幽门螺旋杆菌细胞的最适固定条件
• 3.4.2 Tomlinson 文库每轮筛选结果的ELISA 检测
• 3.4.3 单克隆scFv 的ELISA 鉴定结果
• 3.4.4 测定阳性克隆交叉反应
• 3.4.5 阳性克隆的scFv 基因的PCR 鉴定
• 3.4.6 阳性克隆PIT2 质粒的酶切分析
• 3.4.7 阳性克隆scFv 基因测序
• 3.5 本章小结
• 第四章 幽门螺旋杆菌单链抗体的表达与纯化
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株与文库
• 4.2.2 实验主要试剂
• 4.2.3 实验仪器
• 4.2.4 培养基、溶液的配制及灭菌
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 阳性克隆JH1 可溶性scFv 的表达
• 4.3.2 scFv 的ELISA 检测
• 4.3.3 scFv 的Ni 柱纯化
• 4.3.4 scFv 的 SDS-PAGE 凝胶电泳
• 4.4 实验结果与分析
• 4.4.1 scFv 的ELISA 检测
• 4.4.2 scFv 的Ni 离子柱纯化及SDS-PAGE 分析
• 4.5 本章小结
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文