一个新型假病斑水稻T-DNA插入突变体的研究

论文摘要

水稻是禾谷类作物功能基因组学研究的模式植物。用插入突变建立突变体库,是水稻功能基因组学研究的基本方法。本研究以农杆菌介导法构建的水稻T-DNA插入突变体为材料,筛选得到一个在苗期出现假病斑的新型突变体AZT91,突变性状主要表现为生长缓慢,植株矮小,在叶片中部出现褐色斑,并逐渐向两侧扩散,叶片颜色浅绿,发黄,植株干枯死亡。通过T0代种子的潮霉素抗性筛选、T1代表型分析和潮霉素的抗性检测证实该突变体受隐性基因控制,突变是由T-DNA插入引起的,突变性状与T-DNA共分离。PCR结果进一步证明了上述结论。利用TAIL-PCR克隆了T-DNA插入左边界侧翼序列,分析确定了T-DNA插入位点序列的相关信息,包括在染色体上的位置及与水稻表型相关的可能编码蛋白。TAIL-PCR分离得到唯一片段也证实了该突变体基因组整合了单拷贝的T-DNA。初步推测假病斑突变体AZT91的表型性状是由于T-DNA插入后35S启动子激活邻近的具有单加氧酶特征的基因过量表达,使正常代谢途径失调所致。并克隆了该基因,全长2231bp。

论文目录

• 内容提要
• 英文缩写词表
• 第一篇 文献综述
• 第一章 T-DNA 标签在水稻功能基因组学研究中的应用
• 1.1 突变体构建的方法
• 1.2 水稻T-DNA 插入标签技术
• 1.2.1 T-DNA 标签原理及基因敲除
• 1.2.2 T-DNA 插入标签的研究策略
• 1.2.3 水稻T-DNA 插入突变技术的研究进展
• 1.3 T-DNA 插入侧翼序列获得的主要方法
• 1.3.1 质粒拯救法
• 1.3.2 反向PCR
• 1.3.3 PCR-Walking
• 1.3.4 交错式热不对称PCR
• 第二章 水稻细胞程序性死亡的相关研究
• 2.1 高等植物早衰的研究
• 2.1.1 植物衰老的本质
• 2.1.2 物质代谢与植物衰老
• 2.1.3 衰老的几种假说
• 2.1.4 高等植物衰老的研究方法和策略
• 2.1.5 水稻早衰的研究现状和意义
• 2.2 植物假病斑突变体的研究
• 2.2.1 假病斑突变体的发生机理及类型
• 2.2.2 水稻假病斑突变体的研究
• 2.3 与生物体代谢相关的单加氧酶的初步研究
• 2.3.1 血红素类单加氧酶在植物中的功能
• 2.3.2 黄素类单加氧酶
• 第三章 本论文的研究目的和意义
• 第二篇 研究内容
• 第一章 水稻突变体的获得及遗传分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 转基因水稻T1 代基因组DNA 的小量提取
• 1.2.2 T0 代种子的潮霉素抗性筛选实验
• 1.2.3 T1 代植株的表型鉴定
• 1.2.4 T1 代表型性状与T-DNA 插入事件共分离关系的确定
• 2 结果与分析
• 2.1 T0 代种子潮霉素抗性筛选
• 2.2 假病斑突变体的获得和T1 代表型分析
• 2.3 突变体T1 代叶片的潮霉素抗性实验
• 2.4 突变性状与T-DNA 共分离的PCR 分析
• 2.5 T1 代转基因植株插入位点数的初步研究
• 3 讨论
• 3.1 关于假病斑突变体分析
• 3.2 转基因水稻叶片潮霉素抗性检测的可靠性分析
• 3.3 T-DNA 插入事件和突变体共分离关系的分析
• 3.4 关于T-DNA 插入引起的致死突变的初步分析
• 4 小结
• 第二章 突变体T-DNA 侧翼序列的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 转基因水稻T1 代基因组DNA 的大量提取
• 1.2.2 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.3 T-DNA 插入侧翼序列的TAIL-PCR
• 1.2.4 扩增产物的回收、克隆和测序
• 1.2.5 T-DNA 侧翼序列分析
• 1.2.6 具有单加氧酶特征基因的PCR 克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 T-DNA 插入侧翼序列的获得
• 2.2 重组克隆载体pGEM T-easy 的酶切与PCR 鉴定
• 2.3 TAIL-PCR 产物测序结果及初步分析
• 2.4 具有单加氧酶特征的基因生物信息学分析
• 2.5 具有单加氧酶特征基因的PCR 克隆
• 3 讨论
• 3.1 TAIL-PCR 扩增条件的优化
• 3.2 假病斑突变体发生机制的推测
• 3.3 关于后续的工作
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 详细摘要
• 导师简介
• 作者简介
• CURRICULUM VITAE
• 致谢