论文摘要
心肌细胞凋亡参与了多种心血管疾病的发生及发展,如心肌梗死、心力衰竭及心律失常等。在体内,多种刺激可以诱导心肌细胞的凋亡,包括缺氧、缺血/再灌、氧化应激等。心肌细胞为终末分化细胞,不具有分化潜能,一旦死亡就不可再生。因此抑制心肌细胞凋亡,保护正常心肌细胞功能对治疗多种心血管疾病有重要意义,探寻有效的抑制细胞凋亡的药物或者手段引起了学者们的广泛关注。红景天苷（Salidroside, Sal）为中药红景天的有效活性成份之一,大量的研究证实红景天苷为“适应原性”药物,其具有抗缺氧、抗衰老、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、保肝等作用。Maslova等通过在体试验证实,它还具有保护心肌和抗心律失常的作用,作用机制可能与其导致的内源性类阿片活性肽水平的升高以及应激性儿茶酚胺、c-磷酸腺苷积聚水平的下降有关。但其具体的机制,尤其在细胞水平的机制,至今仍不明确。本实验的目的是在成功建立缺氧诱导的心肌细胞凋亡模型的基础上,观察红景天苷对心肌细胞存活及凋亡的影响,并通过测定缺氧诱导因子（hypoxia induciblefactor-1, HIF-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、3-磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）等蛋白的变化,进一步探讨其抗缺氧诱导的心肌细胞凋亡的可能机制。研究目的1.原代培养SD（Sprague-Dawley）大鼠乳鼠心肌细胞,并通过缺氧建立心肌细胞凋亡模型,观察不同浓度红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响;2.研究红景天苷对HIF-1α及其下游靶蛋白VEGF的影响,探讨红景天苷抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡的可能机制;3.观察PI3K/Akt的阻断剂LY294002对HIF-1α的影响,探讨红景天苷激活HIF-1α表达的可能机制。实验方法1.以原代培养的SD乳鼠心肌细胞作为研究对象,并通过缺氧建立心肌细胞缺氧模型,设立正常对照组、缺氧组、不同浓度红景天苷预处理组（10,50,100μg/mL）及阳性药物预处理组（10-7mol/L胰岛素）。2.相差显微镜、Hoechst 33258染色观察细胞及细胞核形态变化;四唑盐（MTT）比色法观察心肌细胞的存活率;测定细胞培养上清液LDH、CK活力水平观察细胞损伤情况;流式细胞仪,DNA凝胶琼脂糖电泳法测定细胞凋亡。3.通过免疫荧光染色、蛋白免疫印迹观察细胞中HIF-1α及其下游靶蛋白VEGF的表达变化;4. PI3K/Akt的阻断剂LY294002预处理后,通过MTT观察细胞存活率,Hoechst染色、流式及DNA凝胶琼脂糖电泳法观察细胞凋亡,免疫荧光染色、免疫印迹观察细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的表达变化。实验结果1.缺氧1h到8h,心肌细胞存活率明显下降,呈时间依赖性;缺氧6h,细胞的存活率为47.7±10.1%,故选定缺氧6h为后续实验的缺氧时间;2.与缺氧组比较,不同浓度红景天苷预处理组可增加细胞存活率（P <0.05）;显著降低细胞培养上清液LDH、CK活力（P <0.01）;减少Hoechst染色阳性细胞（P <0.01）;流式细胞仪、DNA凝胶琼脂糖电泳法检测凋亡细胞比率降低。100μg/mL红景天苷预处理组与阳性药物10-7M胰岛素组比较无统计学差异（P >0.05）;3.细胞蛋白免疫印迹发现,正常心肌细胞中HIF-1α及其下游靶蛋白VEGF表达处于较低水平,缺氧心肌细胞HIF-1α及VEGF表达较正常细胞明显上调,100μg/mL红景天苷预处理可进一步增加HIF-1α及VEGF蛋白的表达（P <0.01）,可能与红景天苷抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡有关;4. PI3K/Akt的阻断剂LY294002预处理后,红景天苷对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用被显著减弱,细胞存活率明显下降（P <0.01）,细胞凋亡比率明显增加（P <0.01）,琼脂糖凝胶电泳特异性“ladder”灰度明显加深,磷酸化Akt、HIF-1α蛋白表达水平明显降低。结论1.红景天苷可抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡,且在一定浓度范围内具有剂量依赖性;2.红景天苷抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡,促进细胞存活的细胞保护效应可能与促进细胞内HIF-1α及其下游靶蛋白VEGF表达上调有关;3.红景天苷可能通过激活细胞内PI3K/Akt信号通路促进了细胞HIF-1α的表达。