论文摘要
本研究以环六亚甲基双乙酰胺（HMBA）处理人肝癌SMMC-7721细胞,鉴定HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的诱导分化效果。在此基础上,综合应用蛋白质组学、免疫细胞化学、细胞分子生物学等技术,对SMMC-7721细胞诱导分化前后核基质蛋白表达变化进行系统研究,分析鉴定和确证与肿瘤细胞增殖分化相关的特异核基质蛋白,并研究特异核基质蛋白与人肝癌细胞相关癌基因、抑癌基因产物在细胞内的共定位关系与变化,探索它们在肿瘤细胞诱导分化过程中的调控作用。以期能够在较为整体的水平上阐明肝癌细胞诱导分化的调控机制,并进一步认识细胞癌变与逆转机理和细胞增殖与分化的调控原理问题。实验结果显示,5 mmol/L HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖活动具有抑制作用,诱导处理7天后,细胞生长抑制率达50%,细胞倍增时间延长1.8倍,G0/G1期细胞比例由40.6%上升为70.6%,S期细胞比例由27.4%下降为6.9%,细胞周期被阻滞于G0/G1期;光镜和电镜观察结果显示,经5 mmol/LHMBA处理后的SMMC-7721细胞出现核质比减小,细胞体积增大,细胞表面微绒毛减少,细胞核形态趋于规则,核仁数目减少,核内异染色质减少,常染色质增多,线粒体嵴数目增多,内质网和高尔基体更为典型、发达等变化;免疫细胞化学检测结果显示,经诱导处理后,SMMC-7721细胞内癌基因c-fos、c-myc、c-erbB-2、bcl-2以及mtp53表达产物减少,抑癌基因Rb、p21、p27表达产物增多;选择性抽提整装光镜和电镜观察显示,经HMBA处理的SMMC-7721细胞核基质纤维和中间纤维数量和层次更加丰富,分布更为均匀,单丝成份增多,与核纤层连系更为紧密,形成贯穿整个核质区域的较为规则的纤维网络;双向凝胶电泳与MALDI-TOF质谱分析共鉴定出9个在HMBA诱导分化前后差异表达的核基质蛋白,其中表达上调的有4个,分别是p27BBP、BTF2-p44 subunit、tubulin beta 2C、sin3b;表达下调的有4个,分别是突变型pystl、DKFZp434K1815 variant、laminin-binding protein、nucleophosmin:新出现的一个蛋白是SFRS1;蛋白印迹杂交、免疫荧光显微镜和免疫胶体金标记电镜观察确证了nucleophosmin和prohibitin在SMMC-7721细胞诱导分化前后细胞核基质中的表达变化及其在核基质上的定位;激光共聚焦显微镜观察显示nucleophosmin和prohibitin与癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内均存在一定的共定位关系,并且它们的表达水平和细胞定位在诱导分化前后发生了变化。研究结果表明,5 mmol/L HMBA能有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖活动,改变SMMC-7721细胞形态与超微结构特征,下调癌基因c-los、c-myc、c-erbB-2、bcl-2、mtp53和上调抑癌基因Rb、p21、p27等的表达,从而对人肝癌细胞的分化具有显著诱导效果。在SMMC-7721细胞分化过程中,其核基质.中间纤维系统构型产生了与正常细胞相似的恢复性变化,并且出现了多种差异表达的核基质蛋白,其中nucleophosmin和prohibitin为不同诱导分化物诱导多种肿瘤细胞后出现的共同差异核基质蛋白。而nucleophosmin和prohibitin与c-Myc、c-Fos、pRb、mtp53等均存在共定位关系并在SMMC-7721细胞分化过程中出现分布和位移变化的现象。由此证实了HMBA能够干预SMMC-7721细胞相关癌基因、抑癌基因的活性,改变一些与基因表达调控和细胞信号转导相关的重要核基质蛋白的表达,进而阻滞细胞周期,促使人肝癌细胞分化。这为我们在较为整体的水平上深入研究肿瘤细胞诱导分化的调控机制以及阐明细胞癌变与逆转机理提供了科学依据和探索的新方向,并为肿瘤的诊断和抗癌药物的开发提供潜在的靶向性蛋白。
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中文摘要英文摘要前言1.肿瘤细胞诱导分化机理研究及其深入方向2.核基质与核基质蛋白研究3.核基质异常与细胞癌变4.肝癌细胞诱导分化研究及其存在问题5.本论文具体研究工作及其科学意义材料和方法1.试剂与材料2.主要仪器3.细胞培养与诱导分化处理4.人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化过程中生长曲线的测定5.人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化前后细胞周期分布的测定6.苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色及光镜观察7.人肝癌SMMC-7721细胞的扫描及透射电镜样品制备观察8.人肝癌SMMC-7721细胞相关癌基因c-fos、c-myc、bcl-2、c-erbB-2及抑癌基因p53、rb、p21、p27表达产物的免疫细胞化学检测9.人肝癌SMMC-7721细胞核基质-中间纤维系统的选择性抽提10.核基质-中间纤维系统的整装光镜及电镜样品制备与观察11.核基质蛋白组分的提取12.双向聚丙烯酰胺凝胶电泳13.凝胶染色14.凝胶图像分析15.胶内酶解16.质谱分析及数据库检索17.蛋白质印记杂交检测18.免疫荧光染色观察'>19.免疫胶体金标记样品的制备观察</li>20.激光共聚焦显微镜观察样品的制备与观察实验结果1.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞分化的诱导效果1.1.HMBA诱导处理前后SMMC-7721细胞生长曲线的观察结果1.2.HMBA诱导处理过程中SMMC-7721细胞周期的测定结果1.3.HMBA诱导处理前后SMMC-7721细胞形态和超微结构的观察结果1.3.1.光镜观察结果1.3.2.扫描电镜观察结果1.3.3.透射电镜观察结果1.4.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞癌基因、抑癌基因表达的影响1.4.1.SMMC-7721细胞诱导处理前后c-fos表达产物的变化1.4.2.SMMC-7721细胞诱导处理前后c-myc表达产物的变化1.4.3.SMMC-7721细胞诱导处理前后bcl-2表达产物的变化1.4.4.SMMC-7721细胞诱导处理前后c-erbB-2表达产物的变化1.4.5.SMMC-7721细胞诱导处理前后p53表达产物的变化1.4.6.SMMC-7721细胞诱导处理前后Rb表达产物的变化1.4.7.SMMC-7721细胞诱导处理前后p21表达产物的变化1.4.8.SMMC-7721细胞诱导处理前后p27表达产物的变化2.SMMC-7721细胞诱导分化过程中核基质-中间纤维构型的变化2.1.核基质-中间纤维系统的光镜观察结果2.2.核基质-中间纤维系统的整装扫描电镜观察结果2.3.核基质-中间纤维系统的整装透射电镜观察结果3.HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化过程中核基质蛋白表达的变化3.1.双向电泳与凝胶图像分析结果3.2.质谱鉴定与数据库查询结果4.SMMC-7721细胞诱导分化前后特异核基质蛋白表达变化的确证4.1.蛋白质印迹杂交结果4.2.核基质蛋白NPM及PHB的免疫荧光染色观察结果4.2.1.NPM的免疫荧光染色观察结果4.2.2 PHB的免疫荧光染色观察结果4.3 核基质蛋白NPM和PHB在核基质上的定位5.NPM与癌基因c-fos、c-myc以及抑癌基因Rb、p53表达产物在细胞内的共定位观察结果5.1.NPM和c-Fos在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系5.2.NPM和c-Myc在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系5.3.NPM和mtP53在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系5.4.NPM和pRb在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系6.PHB与癌基因c-fos、c-myc以及抑癌基因Rb、p53表达产物在细胞内的共定位观察结果6.1.PHB和c-Fos在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系6.2.PHB和c-Myc在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系6.3.PHB和mtP53在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系6.4.PHB和pRb在人肝癌SMMC-7721细胞内的共定位关系讨论1.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞的诱导分化效果1.1.HMBA对SMMC-7721细胞的增殖与细胞周期进程的影响1.2.HMBA对SMMC-7721细胞形态与超微结构的影响1.3.HMBA对SMMC-7721细胞相关癌基因与抑癌基因表达的影响2.HMBA对人肝癌SMMC-7721细胞分化过程中核基质构型变化的影响3.差异表达核基质蛋白与HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化的关系3.1.人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化前后差异表达的核基质蛋白3.2.差异表达核基质蛋白的功能分析3.2.1.NPM的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.2.2.PHB的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.2.3.突变型Pyst1的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.2.4.sin3b的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.2.5.基础转录因子IIH复合物p44亚基的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.2.6.SFRS1的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.2.7.真核启始因子6的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.2.8.Laminin结合蛋白LBP的功能及其在人肝癌SMMC-7721细胞分化中的可能作用3.3.NPM和PHB在人肝癌SMMC-7721细胞分化过程中与相关基因产物的关系3.3.1.NPM与SMMC-7721细胞中相关癌基因及抑癌基因基因产物的关系3.3.1.1.NPM与c-Myc3.3.1.2.NPM与c-Fos3.3.1.3.NPM与mtP533.3.1.4.NPM与pRb3.3.2.PHB与SMMC-7721细胞中相关癌基因及抑癌基因基因产物的关系3.3.2.1.NPM与c-Myc3.3.2.2.NPM与c-Fos3.3.2.3.NPM与P533.3.2.4.NPM与pRb4.HMBA诱导人肝癌SMMC-7721细胞分化的调控机制结论论文创新点参考文献图版及说明缩略语在校期间发表的论文致谢
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核基质蛋白在人肝癌SMMC-7721细胞诱导分化过程中的变化研究
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