10-HDA抗菌实验的初步研究

论文摘要

10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）,性质稳定,是蜂王浆中一种重要的不饱和脂肪酸,占总脂肪酸的50%左右,在蜂王浆中的含量为1.4%-2.0%。自然界中只有蜂王浆中含有,因此又称王浆酸或蜂王酸。10-HDA具有多种生理活性:它能强壮机体和强烈抑制淋巴癌、乳腺癌等多种癌细胞,增强机体免疫功能,治疗急性辐射损伤和化学物质所致损伤等。本论文主要研究了从蜂王浆中提取10-HDA的工艺流程,并以提取的10-HDA为原料,用常规药敏法和流式细胞仪法检测了10-HDA的抑菌效果,并对10-HDA的抑菌机理做了一个初步的推断。本论文主要采用了二次有机溶剂萃取,两次调pH值的方法来提取蜂王浆中的10-HDA。蜂王浆中10-HDA的最佳提取条件为:先将蜂王浆的水溶液调pH至10,然后加入50 mL乙醚,除去蜂王浆中的脂溶性杂质,再调pH值至2,加入50 mL乙醚,从溶液中提取出10-HDA,旋转蒸发回收乙醚,再加入10mL的乙醇溶解,过滤,回收乙醇即可得到10-HDA的粗提品。接着以提取出的10-HDA为原料,用常规的抑菌圈法和牛津杯法检测了10-HDA对实验室常见的3种细菌和2种酵母的抑菌效果,并用二倍稀释法检测了10-HDA的最小抑菌浓度（MIC）。结果表明:10-HDA最小抑菌浓度和抑菌作用因菌种不同而有所不同,大肠杆菌为1.25 mg?mL-1,最大抑菌圈直径为27.3mm;枯草芽孢杆菌为2.5 mg?mL-1,最大抑菌圈直径为24.4mm;金黄色葡萄球菌为5 mg?mL-1,最大抑菌圈直径为22.5mm;而对酵母无抑制作用。其抑菌效果为:大肠杆菌>枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>酵母,实验表明10-HDA对常见细菌有较好的抑制作用。最后本论文又以大肠杆菌为模板,膜非渗透性荧光染料PI作为探针,用流式细胞仪法进一步探讨了10-HDA的抑菌机理。其结果为:在10-HDA作用于大肠杆菌2h后,其细胞内的PI荧光强度随着10-HDA浓度的增加而不断的增大,并且呈现一定的线性关系。因此可以据此推断:10-HDA作用大肠杆菌后,细胞膜的完整性遭到破坏,其渗透性增强,导致胞内重要生命物质流失,最终致使细胞死亡。流式细胞仪是一种先进的高科技精密仪器,具有简便、快速、灵敏,结果客观、准确等优点,如果将其形成一套成熟的科学方法应用到常规的微生物实验中,必将会引起传统的微生物实验发生革命性的变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 10-HDA 的性质简介
• 1.2.1 研究进展及来源
• 1.2.2 结构
• 1.2.3 物理化学性质
• 1.3 10-HDA 的的生理活性
• 1.3.1 增强免疫功能
• 1.3.2 抗癌、抗肿瘤作用
• 1.3.3 抗辐射作用
• 1.3.4 抑制脂肪合成、降脂作用
• 1.3.5 其它功能
• 1.4 10-HDA 的制备
• 1.4.1 物理提取法
• 1.4.2 化学合成法
• 1.4.3 微生物法
• 1.5 10-HDA 的测定方法
• 1.5.1 分光光度法
• 1.5.2 色谱法
• 1.5.3 酶联免疫吸附法（ELISA）
• 1.5.4 气相色谱-质谱联用法（GC-MS）
• 1.6 立题的背景及研究的目的意义
• 1.7 论文的主要研究内容和任务
• 1.8 论文的基本设计路线
• 第2章 常规法检测10-HDA 的抗菌作用
• 2.1 蜂王浆中提取10-HDA 的研究
• 2.1.1 有机萃取10-HDA 的基本原理及提取路线
• 2.1.2 材料与方法
• 2.1.3 10-HDA 的提取效果的检测
• 2.2 常规法检测10-HDA 抗菌作用的研究
• 2.2.1 纸片法（抑菌圈法）
• 2.2.2 挖孔法
• 2.2.3 挖沟法
• 2.2.4 牛津杯法
• 2.2.5 平皿稀释法
• 2.2.6 试管法（二倍稀释法）
• 2.3 材料和方法
• 2.3.1 实验菌种
• 2.3.2 实验试剂和主要仪器
• 2.3.3 培养基
• 2.3.4 菌悬液和平板的制备
• 2.3.5 不同浓度的10-HDA 的乙醇液和抗生素溶液的制备
• 2.3.6 试管法测定10-HDA 的最低抑制浓度（MIC）
• 2.3.7 纸片法检测10-HDA 的抑菌效果
• 2.3.8 牛津杯法检测10-HDA 的抑菌效果
• 2.3.9 10-HAD 的热稳定性实验
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 10-HDA 的抑菌效果
• 2.4.2 抗生素的抑菌效果
• 2.4.3 10-HDA 的最低抑菌浓度（MIC）
• 2.4.4 10-HDA 的热稳定性
• 第3章 用流式细胞仪检测10-HDA 的抗菌作用
• 3.1 流式细胞仪简介
• 3.1.1 流式细胞仪的主要组件
• 3.1.2 流式细胞仪的工作原理
• 3.1.3 流式细胞仪在生物学中的应用
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验原料和主要仪器
• 3.2.2 FACScomp 自动质控操作
• 3.2.3 质控操作的结果
• 3.2.4 上样的分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 测试菌浓度和PI 最佳染色浓度的选定
• 3.3.2 溶媒的选择
• 3.3.3 死菌细胞与活菌细胞对照管比较
• 3.3.4 流式细胞仪的数据图
• 第4章 流式细胞仪在检测细菌药敏实验的应用展望
• 4.1 流式细胞仪的应用特点
• 4.1.1 快速、灵敏
• 4.1.2 多指标检测
• 4.1.3 稳定、客观的数值
• 4.2 流式细胞仪的发展
• 4.2.1 提高仪器灵敏度和分辨率
• 4.2.2 扩大使用范围
• 4.2.3 提高分析速度
• 4.2.4 实现多色荧光分析
• 4.2.5 改进分选功能
• 4.2.6 软件的发展
• 4.2.7 仪器的自动化
• 4.2.8 提高分析精度
• 4.3 流式细胞仪的应用展望
• 第5章 10-HDA 抑菌机理的探讨
• 5.1 常见抗菌药物作用机制
• 5.1.1 抑制细菌细胞壁合成，使细菌不能生长繁殖
• 5.1.2 影响细菌细胞膜功能
• 5.1.3 抑制细菌蛋白质合成
• 5.1.4 抑制细菌遗传物质的复制或转录
• 5.2 细菌细胞壁和酵母菌细胞壁的区别
• 5.2.1 细菌细胞壁
• 5.2.2 酵母细胞壁
• 5.3 抑制细菌的机理推论
• 第6章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.1.1 10-HDA 的提取
• 6.1.2 常规法检测10-HDA 的抑菌效果
• 6.1.3 流式细胞仪检测10-HDA 的抑菌效果
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文