论文摘要
目的:构建糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）特异的RNAi腺病毒表达载体,从转录后水平抑制GSK-3β基因表达,为研究Wnt/ GSK-3β/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路提供技术工具;并利用构建的RNAi腺病毒感染原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,观察Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路对高游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法:设计合成二对针对GSK-3βmRNA不同位点的shRNA编码序列,克隆到腺病毒穿梭质粒中,然后通过体外同源重组构建重组RNAi腺病毒表达载体;在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法进行病毒滴度测定;腺病毒感染HUVEC,Western Blot和免疫细胞化学法检测其对GSK-3β蛋白表达的抑制效应,并进一步检测对细胞内β-catenin蛋白水平的影响;用游离脂肪酸（FFA）培养细胞,RNAi腺病毒抑制GSK-3β表达,溴脱氧尿苷（BrDU）法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,探讨Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路对高游离脂肪酸作用下HUVEC增殖和凋亡的影响。结果:1.成功构建了针对GSK-3β基因一个位点的RNAi腺病毒表达载体,经PCR和测序鉴定干扰片断的碱基序列及插入位点完全正确;2.在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒,获得高滴度腺病毒上清;3.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以高效抑制GSK-3β蛋白的表达,且对GSK-3β蛋白的抑制作用可持续六天以上;4.构建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以明显增加细胞内β-catenin的蛋白水平,且随着MOI值增加和时间延长β-catenin蛋白量进一步增加;5.腺病毒和/或FFA（0.75 mmol/L）干预HUVEC,72h、96h后Brdu和流式细胞检测,FFA组与正常细胞相比,细胞增殖率明显下降,细胞凋亡率明显增加;RNAi腺病毒组与空病毒组相比,细胞增殖率明显增加,细胞凋亡率差别不明显;RNAi腺病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率增加,细胞凋亡率减少;空病毒+FFA组与FFA组相比,细胞增殖率和凋亡率差别均不明显。结论:构建的GSK-3β特异的RNAi腺病毒能够有效抑制GSK-3β基因的表达,增加细胞内β-catenin蛋白水平,可以作为研究Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路的重要技术手段;上调Wnt/ GSK-3β/β-catenin信号通路可保护高游离脂肪酸诱导的血管内皮细胞损伤。
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