石栎属植物上斑痣盘菌科的分类和齿裂菌属与皮下盘菌属的ISSR分析

论文摘要

本文采用较先进的菌物学分类技术,从形态解剖、个体发育、生态及地理分布、性状培养等方面,对生长在石栎属植物上的斑痣盘菌科中一些种进行较系统的分类研究。同时采用ISSR技术对皮下盘菌属的23个菌株和齿裂菌属的12个菌株进行种内及种间的遗传多样性分析研究,进一步弄清了各分类群之间的系统发育关系。以Darker（1967）、Korf（1973）、Cannon & Minter（1983、1986）、Johnston（1986）、Spooner（1991）、Kirk et al。（2001）等人提出的若干分类原则为主要依据,对源于皖南山区和大别山区生于石栎属植物上的斑痣盘菌科菌物进行分类研究。共查明隶属于齿裂菌属（Coccomyces）、散斑壳属（Lophodermium）2属7种,其中包括等径散斑壳（Lophodermium isodiametum）、拟尖丝齿裂菌（Coccomyces mucronatoides）2个新种;对5个已知种进行了补充研究,使其形态结构、个体发育等特征得以完善,同时追记了它们的寄主新记录和地理新分布。对各种均提供了形态解剖学特征的描述与图解、寄主及生境的记载,并对其相近类群、寄生性与致病性等加以讨论。编制了各属的二又式分种检索表。分别对皮下盘菌属（Hypoderma）的23个分离株和齿裂菌属（Coccomyces）的12个菌株进行了DNA提取,ISSR-PCR扩增体系的优化,并对提取的DNA进行ISSR-PCR扩增反应。采用单因素循环法,寻找一个适合本试验的ISSR-PCR反应体系,以提高其稳定性与重复性。笔者从模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量、退火温度及时间、延伸时间、循环次数等方面对齿裂菌属和皮下盘菌属两属的ISSR反应体系进行了优化,最终确定的ISSR反应体系（15μl）含:10×Taq酶缓冲液为1.5μL,DNA模板为8ng/μL,MgCl2为2.5mmol/L,dNTP为0.15mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq酶为1.0U,ddH2O为9.0μL。扩增程序:94℃预变性2min,接着进行35个循环:94℃变性1min,48～54℃退火（根据不同的引物退火温度来定）1min,72℃延伸2.5min。循环结束后72℃延伸10min。筛选出8个随机引物,使用优化的ISSR-PCR反应参数及程序对齿裂菌属12个菌株的DNA进行扩增,共扩增出134个位点,其中多态性位点数为129个,占总数的96.26%。扩增位点最多的是引物S45,有20个位点数;扩增位点数最少的则是引物S13,只有13个位点数。扩增出的片断长度大多在150-2000bp之间。采用UPGMA方法构建聚类树状图,通过表型性状分类和ISSR分析结果比较,二者能较好地统一起来。按优化的ISSR-PCR反应体系对皮下盘菌23个菌株的DNA进行扩增,8个随机引物共扩增出134个位点,其中多态性位点数为127个,占总数的94.78%。扩增位点最多的是引物S42,有21个位点数;扩增位点数最少的是引物S31、S32、S46,仅有15个位点数。扩增片断长度也是位于150-2000bp之间。使用UPGMA法构建聚类树状图,在遗传相似系数0.58处,23个菌株被分成4类,该结果表明悬钩子皮下盘菌种内遗传差异体现在子囊果形状、大小及埋生深度、侧丝顶端形状、子囊和子囊孢子大小,以及寄主、着生部位和分布区域方面;皮下盘菌属的种问差异主要表现在形态学特征、寄主及着生部位等方面。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1. 斑痣盘菌科的分类历史及现状
• 2. 斑痣盘菌的地理与生态分布
• 3. 分子生物学技术在菌物研究方面的应用进展
• 3.1 分子生物学技术的发展
• 3.1.1 PCR技术
• 3.1.2 RFLP技术
• 3.1.3 VNTR串联重复变异值或小卫星
• 3.1.4 PFGE技术
• 3.1.5 RAPD技术
• 3.1.6 AFLP技术
• 3.1.7 SSR技术
• 3.1.8 ISSR技术
• 3.2 分子生物学技术在菌物分类鉴定上的应用
• 3.2.1 RFLP在菌物分类鉴定上的应用
• 3.2.2 RAPD在菌物分类鉴定上的应用
• 3.2.3 ISSR在菌物分类鉴定上的应用
• 3.3 分子生物学技术的比较与选择依据
• 引言
• 1. 材料与方法
• 1.1 野外生态调查与标本采集
• 1.2 标本汇总与整理
• 1.3 形态结构特征显微检查
• 1.3.1 外部形态特征观察
• 1.3.2 冰冻切片制作
• 1.3.3 内部结构显微检查
• 1.3.4 描述及显微绘图
• 1.4 分类依据
• 1.5 分离与培养
• 1.5.1 供试菌株
• 1.5.2 分离培养
• 1.6 简单重复序列区间（ISSR）分析
• 1.6.1 菌株及来源
• 1.6.2 菌丝培养
• 1.6.3 仪器与试剂
• 1.6.3.1 主要仪器设备
• 1.6.3.2 主要试剂及配置
• 1.6.4 DNA的提取与检测
• 1.6.4.1 DNA的提取
• 1.6.4.2 DNA检测
• 1.6.5 斑痣盘菌基因组DNA的PCR扩增
• 1.6.5.1 引物的选择
• 1.6.5.2 斑痣盘菌ISSR反应体系的优化
• 1.6.6 斑痣盘菌遗传多样性的ISSR分析
• 1.6.6.1 PCR反应体系的建立
• 1.6.6.2 PCR产物的检测
• 1.6.6.3 ISSR谱带的记录及数据分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 斑痣盘菌科的分类
• 2.1.1 有关属的属征
• 2.1.1.1 齿裂菌属
• 2.1.1.2 散斑壳属
• 2.1.1.3 皮下盘菌属
• 2.1.2 分种检索表
• 2.1.3 种的描述
• 2.1.3.1 等径散斑壳 新种
• 2.1.3.2 小散斑壳
• 2.1.3.3 贝壳杉散斑壳
• 2.1.3.4 八角生散斑壳
• 2.1.3.5 拟尖丝齿裂菌 新种
• 2.1.3.6 黄山齿裂菌
• 2.1.3.7 三角形齿裂菌
• 2.2 齿裂菌属与皮下盘菌属的ISSR分析
• 2.2.1 总基因组DNA的提取
• 2.2.2 ISSR反应参数的优化
• 2.2.2.1 DNA模板浓度的影响
• 2+浓度的选择'>2.2.2.2 Mg²⁺浓度的选择
• 2.2.2.3 Taq酶用量的选择
• 2.2.2.4 dNTP浓度的选择
• 2.2.2.5 引物浓度的选择
• 2.2.2.6 退火温度及循环次数的选择
• 2.2.3 ISSR-PCR反应结果
• 3. 结论
• 4. 讨论
• 4.1 关于斑痣盘菌科的分类研究问题
• 4.2 ISSR技术的优、缺点
• 4.3 ISSR分析对皮下盘菌属和齿裂菌属种内及种间关系分析的适用性
• 参考文献
• 图版Ⅰ
• 图版Ⅱ
• 图版Ⅲ
• 致谢
• 作者简介