论文题目: 基于IBV重组表达蛋白的抗体检测技术及基因免疫研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 张德勇
导师: 周继勇
关键词: 传染性支气管炎病毒蛋白,蛋白,基因免疫
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: 以近年从浙江、四川等地分离到的鸡传染性支气管炎病毒肾致病型毒株以及传统的IBV经典毒株为材料,设计特异性引物,分别克隆了IBV的S1基因和N基因并测定序列,用DNAstar等软件进行分析。S1基因和N基因的序列比较显示,国内分离到的部分毒株间同源性最高(82.9%到98.6%),但它们与传统的毒株相比同源性较低。在分离株的S1基因和N基因序列中均发现了大量散在的点突变,而且在SC021202株和J株的Sl基因中发现一段长21nt的插入片段,在以前的毒株中不存在。这些特征显示国内近年流行的一些IBV毒株是新的变异株,有着相对独立的起源和进化方向。 在大肠杆菌pBAD/his系统中表达了IBV的N蛋白,表达量约占菌体总蛋白的20%。同时在大肠杆菌pGEX表达系统中高效表达了IBV S蛋白的S1F表位片段和SlD表位片段。大肠杆菌中表达的N蛋白和S1蛋白均可与IBV多抗血清发生特异性反应,并通过Ni柱纯化出了表达的外源蛋白。此外,还将IBV S1基因构建到酵母表达载体pPICZ α B中,电转化酵母X33菌株,得到四个阳性克隆,经甲醇诱导可分泌型其中三株可表达IBV的S1糖蛋白,表达的蛋白可与多抗血清发生特异性反应。 以纯化到的N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法(N-ELISA),可以检测出鸡血清中的抗IBV N蛋白的特异性抗体。对N-ELISA的反应条件进行了优化,包被液以PH 8.5的Tris-HCI包被效果最佳,抗原包被量确定为0.19 μg/孔,一抗(待检血清)的稀释度确定为1:100,酶标二抗HtRP标记的兔抗鸡IgG)确定为l:800。用N.EL,ISA检测IBV及其他病原的抗血清,结果证实N-ELISA可检测出针对各IBV毒株的抗体而其它病原的抗血清均检测为阴性,说明N-ELISA具有良好的特异性,此外,用N-ELISA与IDEXX公司的ELISA试剂盒同时检测临床样本95份,两种方法检出的总阳性率符合率达到95.7%。以表达的SlF为包被抗原,通过类似的方法建立了间接ELISA方法(SlF-ELISA),可以检测出鸡血清中抗S蛋白的特异性抗体。抗原包被浓度确定为0.6 μg/孔,一抗和酶标二抗的稀释度分别为l:50和l:800。SlF-ELISA可以检测针对不同毒株的IBV的抗血清而其他病原体的抗血清均较检测为阴性说明SlF-ELISA具有理想的特异性。用SlF-ELISA检测来自临床的免疫鸡血清样本34份,与IDEXX试剂盒的结果比较,其阳性率均为100%。 以纯化的N蛋白、S1D蛋白、S1F蛋白分别免疫BALB/e小鼠,通过杂交瘤技术制备除了8株抗N蛋白的单克隆抗体、3株抗S1D蛋白的单克隆抗体、6株抗S1F的单克隆抗体。抗体亚类鉴定显示17株单抗均为IgG1,K链。通过western
论文目录:
摘要
第一部分 文献综述
第一章 传染性支气管炎病毒研究进展
第二章 禽类DNA疫苗研究进展
第二部分 研究内容
第一章 IBV S1基因的克隆及序列分析
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第二章 IBV N基因的克隆及序列分析
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第三章 IBV S1基因(部分)在大肠杆菌中的表达
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第四章 IBV S1基因在酵母中的表达
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第五章 IBV N基因在大肠杆菌中的表达
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第六章 抗IBV S1蛋白单克隆抗体及多抗血清的制备
1．材料和方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第七章 抗IBV N蛋白单克隆抗体及多抗血清的制备
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第八章 基于S1蛋白的ELISA检测方法的建立
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第九章 基于IBV重组N蛋白的ELISA检测方法建立
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
第十章 IBV的DNA免疫研究
1．材料与方法
2．结果
3．讨论
参考文献
附录1：溶液与试剂配方
附录2：作者读研究生期间已发表论文
附录3：读研究生期间所获奖励
发布时间: 2005-10-10
参考文献
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