论文摘要
来源于胚胎内细胞群（inner cell mass, ICM）的ES细胞（embryonic stem cells）)和来源于原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）的EG细胞（embryonic germ cells）因其能在体外无限增殖,并具有多向分化潜能和种系嵌合能力,而成为生命科学领域倍受关注的焦点。小鼠胚胎干细胞有着重要而广阔的研究价值,尤其在哺乳类动物发育生物学研究上有着其它种族胚胎干细胞难以替代的优势和重要地位。小鼠胚胎干细胞是哺乳类动物发育生物学研究的理想体外模型,通过小鼠胚胎干细胞体外培养平台的建立,寻找哺乳动物胚胎发育决定和细胞定向谱系分化等重要生物学调控事件中的关键因子,是人类干细胞工程今后应用于临床疾病治疗的重要基础研究工作。此外,PGCs和EG细胞作为“干细胞之母”,对于研究生殖细胞发育、分化、成熟的调节机制以及生殖系肿瘤的发生机制有重要理论意义。发育生物学和干细胞应用两个领域相辅相成,共同的焦点是多能干细胞的自我更新机制和分化机制。多年来体内ICM、PGCs以及体外ES细胞、EG细胞保持多能性和自我更新的机制一直是科研工作研究热点,但迄今为止仍不清楚,而由于EG细胞分离培养难度相对较大,目前对PGCs及EG细胞的研究更为滞后。早期胚胎发育和ES细胞自我更新及分化机制的研究结果表明：多能干细胞特异转录因子Oct-4、Nanog以及HMG-box家族转录因子成员Sox2位于细胞全能性调控网络的顶端,共同调节与自我更新、多能性以及分化相关的下游基因,它们是保持内细胞群以及ES细胞自我更新和多潜能性的核心物质。各种纷繁复杂的外源信号最终正是作用于上述多能干细胞标志基因,从而决定细胞的多能性表型。PGCs是指在进入与体细胞有密切接触的生殖腺成为真正的生殖细胞之前,短暂存在于胚胎的双倍体生殖细胞前体。PGCs具有双重身份和双重研究价值：其一,在体内PGCs能定向发育为成熟生殖细胞配子,毫无疑问它是生殖细胞的前体细胞；其二,体外适宜条件下PGCs能长期培养称为EG细胞,它和ES细胞同属于胚胎干细胞。探明PGCs增殖、定向分化形成生殖干细胞的发育机制对于生殖系统发育异常的诊疗以及干细胞工程的应用具有双重指导意义。Nanog是发育生物学和干细胞生物学领域的新兴研究热点,但现有研究多集中于Nanog对早期胚胎以及ES细胞的多能性维持。为了进一步探索ES细胞自我更新分子调控机制以及探讨Nanog对胚胎发育过程中PGCs的调控机理,我们进行了以下研究：1.比较小鼠胚胎成纤堆细胞（Mouse embryonic fibroblasts, MEFs）和永生化的STO细胞两种饲养层细胞的生物学特性,建立适宜的胚胎干细胞饲养层体系。2.建立ES细胞和EG细胞体外培养平台。3.观察分析Nanog在小鼠原始生殖细胞发育过程中的表达谱。4.通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）介导Nanog基因沉默观察对EG细胞的影响。上述研究内容简介如下：1、MEFs和STO饲养层体系的建立：本研究以13.5dpc-14.5dpc胎鼠为材料,采用酶消化结合组织块培养法,成功分离培养获得MEFs。MTT生长曲线测定和FACS细胞周期时相测定显示：STO细胞增殖较MEFs快,需要传代的周期短。MTT结果显示：丝裂霉素C10μg/ml作用2.5h～3.5h、20 μ g/ml作用1.5h～2.5h能有效抑制MEFs的有丝分裂,MEFs饲养层在7d内能完全维持在稳定水平。丝裂霉素C5μg/ml-10μg/ml作用1.5h～2.5h能有效抑制STO细胞的有丝分裂,STO饲养层在5d内相对稳定。根据生长特性,ES细胞原代分离培养更适宜选择MEF作为饲养层。集落计数表明MEFs和STO饲养层对EG细胞克隆形成无显著性差异,而FACS检测表明：STO细胞表达粘附分子CDPC44荧光强度明显高于MEF,提示STO细胞较MEFs可能有粘附力更强的优势,适宜作EG细胞培养的饲养层,但STO细胞对EG细胞核型异常有一定影响。本研究从优化实验条件的角度出发,探讨两种细胞来源饲养层在本实验室的适宜应用条件,为分离克隆胚胎干细胞奠定了可靠的实验基础。2、小鼠ES、EG细胞的体外分离、纯化、培养与鉴定：本研究采用全胚培养法,以3.5dpc小鼠囊胚ICM为来源分离培养ES细胞,以MEFs为饲养层,5d左右ICM增殖形成圆柱状结构,ICM细胞团在新的饲养层上初次传代培养,获得ES细胞集落,集落能进行传代培养,传代ES细胞具有高度碱性磷酸酶活性,表达SSEA-1抗原,但未能完成大规模扩增。以11.5dpc小鼠胚胎生殖嵴为来源,酶消化结合机械分离法分离培养PGCs, PGCs在STO饲养层上能扩增形成典型EG细胞集落,集落能稳定传代。经碱性磷酸酶组织化学、SSEA-1免疫组化、Oct4免疫荧光染色及Nanog RT-PCR鉴定传代培养的EG细胞能维持未分化状态；体外培养可分化形成囊状类胚体,提示EG细胞具有多向分化潜能；核型分析显示EG细胞能保持较高的正常核型水平。本研究成功建立了EG细胞体外培养平台,为进一步研究胚胎干细胞自我更新重要相关因子对胚胎生殖细胞的调控机制奠定了基础。而对于来源细胞数量极少的ES细胞的大量扩增还有待进一步探索。3、Nanog在小鼠原始生殖细胞发育过程中的的时空表达：本研究采用胚胎连续石蜡切片、免疫荧光方法定性研究Nanog在PGCs的表达,结果表明：7.5dpc、8.5dpc胎鼠尿囊,9.5dpc、10.5dpc胎鼠后肠及背肠系膜,11.5dpc胚胎原始生殖嵴及周围肠系膜内均可见Nanog阳性表达。12.5dpc-14.5dpc胚胎生殖腺内也可见Nanog表达阳性细胞,但随胚胎胎龄增大,荧光强度逐渐减弱,15.5dpc胚胎Nanog表达阴性。进一步采用免疫荧光定量分析性腺分化前后11.5dpc～15.5dpc胎鼠PGCs中Nano g的表达变化,激光共聚焦分析结果表明：11.5dpc胎鼠PGCs中Nanog表达阳性率和荧光强度最强。雌性和雄性胎鼠分别于12.5d、13.5d后Nanog表达急剧下降。综合以上结果表明：Nanog在增殖的小鼠PGCs中稳定表达,在分化性腺中表达下降。提示Nanog可能与PGCs的未分化状态维持及分化有关；Nanog与Oct4表达谱的相似性提示这两个因子功能的相关性。4、RNAi介导Nanog基因沉默对EG细胞的影响研究：本研究在观察分析小鼠体内PGCs发育过程中N anog表达变化的基础上,进一步采用RNA干扰技术深入研究Nanog对EG细胞的影响。免疫荧光和半定量RT-PCR结果表明化学合成siRNA在48h内能有效抑制Nanog表达。转染Nanog siRNA48、时后,典型未分化EG细胞集落数量显著性下降,表明Nanog是维持EG细胞自我更新保持未分化状态的关键因子。半定量RT-PCR结果表明伴随Nanog表达下调,生殖细胞特异基因vasa表达显著性上升,减数分裂标志SCP3表达阳性,提示Nanog表达下调与生殖细胞分化启动相关。通过透射电镜和TUNEL法检测,RNAi抑制Nanog表达还可导致EG细胞发生凋亡,提示多能性干细胞特有的内源性转录因子对抑制多能干细胞凋亡有重要作用。结合本研究第三部分Nanog在增殖PGCs中稳定表达,在分化性腺中表达下降的体内实验结果,本研究表明Nanog对发育过程中PGCs未分化状态维持、性腺分化起着关键性作用。综上所述,本研究采用现代生物学技术在比较两种饲养层细胞生物学特性,优化饲养层体系的基础上建立了ES细胞和EG细胞体外培养平台。结合Nanog在体内PGCs的表达谱分析,我们以EG细胞模拟体内的PGCs,通过化学合成siRNA沉默Nanog的方式进一步探讨了Nanog对发育过程中PGCs的可能调控机制,从发育生物学的角度对PGCsEG细胞的自我更新及分化机制进行了有益的探索。