论文摘要
目的:以糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）特异的RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体作为研究工具,从转录后水平抑制GSK-3β基因表达,初步探讨Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）信号途径对人甲状腺细胞增殖凋亡的影响。方法:设计合成针对GSK-3βmRNA序列的短发夹RNA（shRNA）编码序列,克隆到腺病毒穿梭质粒中,然后通过体外同源重组构建重组RNAi腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度;腺病毒感染原代培养人甲状腺细胞,Western blot法检测其对GSK-3β表达的抑制效应,并探讨不同感染复数（MOI）及病毒感染时间对GSK-3β的抑制效应;利用RNAi腺病毒抑制GSK-3β表达,溴脱氧尿苷（BrDU）法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,探讨Wnt/β-catenin信号途径对人甲状腺细胞增殖和凋亡的影响。结果:1.成功构建了GSK-3β特异的RNAi腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装、扩增腺病毒,获得高滴度腺病毒上清,测定扩增第二代的病毒液滴度在1.6×1010pfu～5.0×1010pfu之间,可满足后续实验需要。2.RNAi腺病毒感染人甲状腺细胞后可使GSK-3β表达量明显下降,RNAi腺病毒MOI值为100时可实现对细胞GSK-3β表达的有效抑制;RNAi腺病毒感染后48h开始检测到GSK-3β表达量下降,且随时间延长GSK-3β表达量进一步减少,抑制效应可持续至少6天;RNAi腺病毒感染人甲状腺细胞后β-catenin表达量显著增加。3.腺病毒感染人甲状腺细胞1day、3day、5day、7day后,RNAi腺病毒组与空病毒组相比,细胞增殖率明显增加（P<0.05）;但流式细胞检测结果提示RNAi腺病毒感染对细胞凋亡的影响不明显。结论:构建的GSK-3β特异的RNAi腺病毒表达载体能有效抑制GSK-3β基因表达,可以作为研究Wnt /β-catenin信号途径的工具;Wnt/β-catenin信号途径对原代培养人甲状腺细胞增殖有重要影响。
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