生物催化水解2-氨基-4-甲硫基丁腈制备蛋氨酸的研究

论文摘要

蛋氨酸（Met）作为唯一含硫的骨架氨基酸,广泛运用于饲料、食品、医药及化妆品等领域。目前,Met的生产方法主要有化学法。本文主要以2-氨基-4-甲硫基丁腈为底物,采用生物催化生产Met。首先建立了 2-氨基-4-甲硫基丁腈、2-氨基-4-甲硫基丁酰胺及Met的液相色谱分析方法,然后采用富集培养和定向筛选技术,以底物2-氨基-4-甲硫基丁腈为唯一氮源,筛选得到八株具有催化2-氨基-4-甲硫基丁腈生产Met的野生菌株;通过形态特征、生理生化特征、16SrDNA序列、系统发育树分析,ZJB-12001被鉴定为Pseudomonas fluorescens;并已保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉）,保藏号为CCTCCM2012449。以ZJB-12001为出发菌株,通过单因素和正交试验得到了该菌催化2-氨基-4-甲硫基丁基制备Met的最适培养基组成（g/L）:甘油15.80、柠檬酸三钠14.70、酵母粉32、谷氨酸钠5、己内酰胺0.5、MgS04·7H200.15、KH2P04 0.75、K2HP04·3H20 0.75。在此基础上,对 ZJB-12001的培养条件进行了研究,发现菌种产酶和生长的最适初始pH为7.5,温度为28℃,接种量为4%,装液量为16%。在上述条件下,测定了该菌的发酵生长曲线,最佳产酶时间为48h,酶活力为152.30U/L,生物量7.43 gDCW/L,分别是优化前的5.59倍和2.09倍。菌株ZJB-12001静息细胞催化2-氨基-4-甲硫基丁腈制备Met的最适反应体系为pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液,最佳反应温度为45℃;菌体催化温度在25～45℃范围时,遵循Arrhenius方程,表观活化能Ea=21.88kJ/mol,且在 40、45 和 50℃ 的半衰期分别为 97.76、54.92和5.94 h;该菌催化反应不需要金属离子做为辅酶,且受底物和产物毒害作用大;静息细胞使用批次不理想,缓冲体系中重复使用第七次时,酶活力只有第一次使用时的11.46%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 腈转化酶的概述
• 1.1.1 腈转化酶的催化途径及酶类
• 1.1.2 腈转化酶在精细化学品生产中的应用
• 1.2 腈水解酶的概述
• 1.2.1 腈水解酶的来源
• 1.2.2 腈水解酶的催化机理
• 1.3 Met的概述
• 1.3.1 Met的理化性质
• 1.3.2 Met的功能及应用
• 1.4 Met的合成方法及研究现状
• 1.4.1 化学法合成研究现状
• 1.4.1.1 丙烯醛法
• 1.4.1.2 丙二酸酯法
• 1.4.1.3 氨基内酯法
• 1.4.1.4 固-液相转移催化法
• 1.4.2 生物法合成研究现状
• 1.4.2.1 酶拆分法
• 1.4.2.2 发酵法
• 1.4.2.3 化学-酶法
• 1.5 论文的选题意义及研究内容
• 1.5.1 选题意义
• 1.5.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 腈水解酶菌株的筛选及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.0 菌种来源
• 2.2.1 化学试剂与主要仪器
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 菌株的初筛
• 2.2.4 菌株的复筛
• 2.2.5 分析检测条件
• 2.2.6 酶活定义
• 2.2.7 形态特征观察
• 2.2.8 生理生化特征的测定
• 2.2.9 基因组提取
• 2.2.10 16S rDNA序列扩增
• 2.2.11 系统发育学分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 产腈水解酶菌株的筛选
• 2.3.2 形态特征
• 2.3.3 生理生化鉴定
• 2.3.4 16S rDNA序列测序结果
• 2.3.5 系统发育分析
• 本章小结
• 参考文献
• 第三章 腈水解酶产生菌P. fluorescens ZJB-12001培养条件的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 仪器与试剂
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 菌体培养
• 3.2.5 菌体制备
• 3.2.6 生物量测定
• 3.2.7 静息细胞转化
• 3.2.8 酶活的定义
• 3.2.9 分析检测方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 发酵培养基组成的优化
• 3.3.1.1 碳源的筛选
• 3.3.1.2 复合碳源不同比例对菌体产酶和生长的影响
• 3.3.1.3 复合碳源浓度对菌体产酶和生长的影响
• 3.3.1.4 氮源的筛选
• 3.3.1.5 复合氮源不同比例对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.1.6 复合氮源浓度对产酶及菌体生长的影响
• 3.3.1.7 金属离子对产酶和生长的影响
• 3.3.1.8 金属离子浓度对产酶和生长的影响
• 3.3.1.9 诱导剂的筛选
• 3.3.1.10 诱导时机对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.1.11 诱导剂浓度对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.1.12 正交试验
• 3.3.2 其它培养条件对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.2.1 培养基初始pH值对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.2.2 培养温度对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.2.3 接种量对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.2.4 装液量对产酶和菌体生长的影响
• 3.3.3 发酵生长曲线的测定
• 本章小结
• 参考文献
• 第四章 P.fluorescens ZJB-12001静息细胞催化2-氨基-4-甲硫基丁腈制备Met反应条件的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 仪器与试剂
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 菌体培养及收集
• 4.2.5 静息细胞转化
• 4.2.6 酶活定义
• 4.2.7 分析检测方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 有机溶剂对催化的影响
• 4.3.2 反应体系pH对催化的影响
• 4.3.3 缓冲体系及水相体系转化进程对比
• 4.3.4 反应温度对催化的影响
• 4.3.5 温度稳定性的研究
• 4.3.6 金属离子及添加剂对催化反应的影响
• 4.3.7 底物抑制
• 4.3.8 产物抑制
• 4.3.9 不同底物浓度转化进程的研究
• 4.3.10 菌体使用批次的研究
• 4.3.11 催化途径的探究
• 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 附录1
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文