胶体金核酸层析检测5种检疫性植物病毒的研究

论文摘要

随着经济全球化进程的加快，外来检疫性有害生物问题日益严重，直接威胁着我国的农业生产安全。建立快速、准确、灵敏的植物病毒检测方法，是有效防控检疫性植物病毒传入的重要手段，对于我国国家生物安全有着重要而深远的意义。本文选择我国进境植物检疫性有害生物名单中的番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus, ToRSV）、烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus, TRSV）、南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus,ArMV）、番茄黑环病毒（Tomato black ring virus, TBRV）、菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus, BPMV）等5种检疫性病毒为研究对象，将核酸扩增的高灵敏度和胶体金免疫层析方法的快速简便、直观的优点结合起来，建立了检疫性植物病毒PCR扩增产物的胶体金层析快速检测方法。5种病毒的PCR检测：依据ToRSV、TRSV、ArMV、TBRV和BPMV等5种病毒基因组中的特异性保守序列，分别设计合成了相应的PCR引物。并对每种病毒的一对PCR引物分别进行标记，用生物素标记一条引物，用荧光素（或地高辛）标记另一条引物，通过PCR扩增产生双标记的扩增产物，利用胶体金试纸条对扩增产物进行检测。胶体金试纸条的制备：用传统的柠檬酸三钠还原法制备出20-30nm胶体金颗粒。对比了生物素抗体、亲和素、链霉亲和素等物质与生物素的结合效果，选择其中效果最好的生物素抗体（兔抗生物素多克隆抗体）标记在胶体金上。在试纸条抗体固相硝酸纤维素层析膜（NC膜）上靠近玻璃纤维素膜的一端点上1μL的荧光素单克隆抗体（或地高辛单克隆抗体）作为T检测点。在NC膜上靠近吸水纸一端点上1μL羊抗兔多克隆抗体作为C质控点。PCR产物经试纸条检测：混合金标抗体，双标记的PCR产物和PBS缓冲液，插入试纸条进行检测。计时15min，C点和T点都显色检测结果阳性，C点显色而T点不显色则检测结果阴性，C点不显色则结果不能判断。利用这种胶体金核酸层析法成功检测了上述5种病毒，该方法更为简便、快速。利用所建立的胶体金核酸免疫层析试纸进行了双重检测，即在一张试纸条上同时检测两种病毒，成功检测了TRSV和ToRSV，TBRV和ArMV的组合。本文还研究了PCR-ELISA检测方法，将标记上生物素-荧光素（或地高辛）的PCR产物进行酶联免疫吸附检测，结果表明标记地高辛的PCR产物在稀释到1000倍还能够检测到，但是标记荧光素的PCR产物的检测效果不理想。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 五种检疫性植物病毒概况
• 1.1.1 菜豆荚斑驳病毒
• 1.1.2 南芥菜花叶病毒
• 1.1.3 番茄环斑病毒
• 1.1.4 烟草环斑病毒
• 1.1.5 番茄黑环病毒
• 1.2 植物检疫性病毒检测方法的研究进展
• 1.2.1 生物学检测
• 1.2.2 血清学检测
• 1.2.3 分子生物学检测
• 1.2.4 多种方法结合检测
• 1.3 胶体金核酸层析的原理
• 1.3.1 PCR 的原理
• 1.3.2 胶体金免疫层析原理
• 1.3.3 亲和素一生物素系统
• 1.4 研究目的及意义
• 1.5 研究内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试病毒样品
• 2.1.2 供试植物
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.1.4 特异性引物和探针
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RT-PCR
• 2.2.2 胶体金免疫层析
• 2.2.3 胶体金核酸层析
• 2.2.4 胶体金核酸层析灵敏度检测
• 2.2.5 试纸条双重检测
• 2.2.6 PCR-ELISA
• 2.2.7 胶体金核酸层析不同层析膜的检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 PCR 产物扩增结果
• 3.2 胶体金核酸层析测试结果
• 3.2.1 成功的组合
• 3.2.2 组合 5 的检测结果
• 3.2.3 测试失败的几种组合的原因分析
• 3.3 胶体金核酸层析灵敏度测的结果
• 3.4 PCR 产物试纸条双重检测的结果
• 3.4.1 TRSV 和 ToRSV 组合的检测结果
• 3.4.2 TBRV 和 ArMV 组合的检测结果
• 3.5 PCR-ELISA 检测结果
• 3.5.1 ArMV 的 PCR-ELISA 检测结果
• 3.5.2 TRSV 的 PCR-ELISA 检测结果
• 3.5.3 ToRSV 的 PCR-ELISA 检测结果
• 3.5.4 TBRV 的 PCR-ELISA 检测结果
• 3.5.5 BPMV 的 PCR-ELISA 检测结果
• 3.6 胶体金核酸层析不同层析膜检测
• 3.7 没有成功的实验分析
• 3.7.1 不对称 PCR-免疫层析检测
• 3.7.2 等温核酸扩增-免疫层析检测
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及参与项目