论文摘要
第一部分CD8+T细胞在1型糖尿病发病中的作用目的1型糖尿病是T细胞介导的自身免疫性疾病,其自身免疫过程包括临床糖尿病前期（即胰岛炎期）和显性糖尿病期,最近的遗传学资料及研究结果表明,T细胞可作为预防1型糖尿病的靶细胞。因此,T细胞在1型糖尿病发病中作用的研究是目前1型糖尿病研究的热点。大量组织学分析和T细胞转移实验研究表明,T细胞亚群CD4+T细胞和CD8+T细胞,在1型糖尿病发病中都是必不可少的,但它们在糖尿病进程中各自的作用仍不明确。本研究,旨在探讨CD8+T细胞是否启动了胰岛炎,如果是,CDS+T细胞是怎样启动糖尿病发生的。方法用NOD鼠和基因工程构建的NOD背景的转基因鼠作为本研究的动物模型,用PCR和流式细胞技术鉴定实验动物的基因型（图2-8）。过继转移前,先从供鼠分离新鲜脾细胞,通过特异性抗体染色、流式细胞分析,确证所要转的细胞种类,计算所要转移的细胞数量,然后将一定数量的供鼠新鲜脾细胞腹腔注射给受鼠,采尾静脉血监测受鼠血糖,并将未发生糖尿病的受鼠胰腺用免疫组化技术,进行胰岛炎的评估。过继转移时,首先检验幼年（2周龄）的NOD鼠是否带有致糖尿病的T细胞、NOD鼠T细胞的致糖尿病能力是否随着供鼠年龄的增长而增加,以及是否幼年NOD鼠体内缺少β细胞自身抗原的表达。然后研究β细胞上共刺激分子CD80的表达对CD4+T细胞和CD8+T细胞致糖尿病能力的影响,评估β细胞上表达共刺激分子CD80对未被免疫的静止CD8+T细胞的作用。用CFSE分子探针标记NOD.scid.CL4 TCR转基因供鼠的脾细胞,将标记的脾细胞过继转移给NOD.scid.InsHA鼠或NOD.scid鼠,用流式细胞技术评价转移后不同时间受鼠的脾、胰腺淋巴结和胰岛中,HA特异性的CL4 CD8+T细胞的增殖和活化通情况。采用SPSS11.0软件包进行统计分析,两样本率的比较采用四格表资料的x2检验,多个样本率的比较采用行×列表资料的x2检验。结果1.14天龄NOD鼠的脾细胞被转移给6～8周龄的NOD.scid鼠（n=36）和年龄匹配的NOD.scid.Rip.B7鼠（n=35）,在转移脾细胞后9周,当68.6%NOD.scid.Rip.B7受鼠发生糖尿病时,NOD.scid受鼠组尚没有检测到胰岛淋巴细胞浸润（图9）。转移脾细胞后11周,80%的NOD.scid.Rip.B7鼠发生糖尿病（图13 B所示）。但在NOD.scid受鼠组,即使转移后20周,尚没有1例受鼠发生糖尿病。2.我们将相同数量（2×107个脾细胞/受鼠）的、不同周龄的NOD鼠的脾细胞分别转移给相同周龄的NOD.scid受鼠,观察T细胞的致糖尿病能力在不同周龄NOD供鼠的变化。正如图14～17所示,2周龄NOD鼠的脾细胞过继转移给6～8周龄的NOD.scid鼠（受鼠n=36）时,转移后20周仍然没有受鼠发生糖尿病;转移3周龄NOD鼠的脾细胞时（NOD.scid受鼠n=35）,转移后13周时开始有受鼠发生糖尿病（5%）,到转移后25周时有约30%的受鼠发生糖尿病;当转移4周龄NOD鼠的脾细胞时（NOD.scid受鼠n=36）,转移后12周时开始有受鼠发生糖尿病（10%）,到转移后20周时有约50%的受鼠发生糖尿病;而转移6周龄NOD鼠的脾细胞时（NOD.scid受鼠n=37）,转移5周后（36天）开始有NOD.scid受鼠发生糖尿病,到转移后9周时有约65%的受鼠发生糖尿病,转移后13周时,100%的受鼠发生糖尿病。经多个样本率之间两两比较,在转移后同一时间,不同周龄的NOD供鼠在相同受鼠中诱导的糖尿病发病率有显著性差异（P＜0.001）。3.幼年（2周龄）NOD鼠的脾细胞不能诱导NOD.scid受鼠发生糖尿病,是否幼年NOD鼠体内缺少β细胞自身抗原的表达?我们进一步用过继转移试验回答上述问题。从已发生糖尿病的NOD鼠分离脾细胞并注射给新生的（n=30）以及1周龄（n=32）,2周龄（n=34）,3周龄（n=32）,6周龄（n=36）的NOD.scid鼠（结果见表2）。所有年龄组的受鼠均在接受转移细胞后5周左右开始发病,转移后9周时所有年龄组受鼠100%发病。尽管受鼠的年龄不同,但它们发生糖尿病的时间却相似（图13A）。经行×列表资料的x2检验,P＞0.05,说明在转移后同一时间,不同周龄的受鼠糖尿病发病率的差异无统计学意义。4.从9～10天龄的BDC2.5/NOD.scid鼠的脾脏分离出BDC2.5 CD4+T细胞,将5×105个CD4+T细胞转移给6～8周龄的NOD.scid鼠（n=40）和NOD.scid.Rip.B7鼠（n=40）。两组受鼠都是从转移后12天开始发病,到转移后15天时,两组受鼠糖尿病发病率均为100%（图18A）,经x2检验,两组受鼠糖尿病发病率的差异无统计学意义（P＞0.05）。然后我们将不同数量的BDC2.5 CD4+T细胞转移到年龄匹配NOD.scid和NOD.scid.Rip.B7受鼠,各组受鼠数量均为40只。结果不论我们转移了多少BDC2.5CD4+T细胞,在NOD.scid.Rip.B7受体组和NOD.scid对照组所诱导的糖尿病发生率及发病特点都是相似的（图18A～D）,该结果证明了β细胞上共刺激分子CD80的表达对CD4+T细胞的致糖尿病性是没有影响的。5.从4周龄的NOD.Ragnull.AI4 TCR转基因鼠分离脾细胞作为活化的CD8 T细胞,将相当于7×105个CD8+T细胞的脾细胞转移至NOD.scid（n=35）或NOD.scid.Rip.B7（n=40）鼠（表3）。虽然两组受鼠均发生糖尿病,但发病速度明显不同,转移后24天,当NOD.scid.Rip.B7组受鼠全部发生糖尿病时（发病率100%）,NOD.scid对照组糖尿病发病率只有14.3%,经x2检验,两组发病率有显著性差异（P＜0.001）。转移相当于7×104个CD8+T细胞的脾细胞时,转移后45天,NOD.scid.Rip.B7组受鼠全部（n=40）发生糖尿病时（表4）,NOD.scid对照组（n=35）糖尿病发病率只有17.1%,经x2检验,两组发病率的差异有统计学意义（P＜0.001）。两组试验尽管供鼠与受鼠相同,由于转移的细胞数不同,相同受鼠发生糖尿病的速度却是明显不同的。从9～10天龄NOD.Ragnull.AI4 TCR转基因鼠分离脾细胞,将相当于7×105个CD8+T细胞的脾细胞转移至NOD.scid.Rip.B7鼠（n=32）和NOD.scid对照鼠（n=30）。31天后NOD.scid.Rip.B7组开始有受鼠发生糖尿病,在转移脾细胞后55天NOD.scid.Rip.B7受鼠100%发生糖尿病（图20A）。静止的CD8+T细胞所诱导的糖尿病的发生及其发病率与已发生糖尿病的AI4 TCR转基因鼠及糖尿病前期的AI4TCR转基因鼠的脾细胞所诱导的糖尿病的发生及其发病率相似。NOD.scid组在转移60天后尚未发现有受鼠发生胰岛炎,但在120天时NOD.scid组的部分受试对象发生外周胰岛炎和胰岛炎（图20B）。6.将9～10天龄NOD.Ragnull.AI4 TCR转基因鼠的静止的AI4 CD8+T细胞转移到NOD.scid.β2mnull.Rip.B7鼠和NOD.scid.Rip.B7鼠各40只。NOD.scid.Rip.B7组被迅速诱发糖尿病（图21所示）,在转移后23天开始有受鼠发生糖尿病,转移后35天100%受鼠发生糖尿病。但作为对照,NOD.scid.β2mnull.Rip.B7组即使在转移后80天也无1例受鼠发生糖尿病。当我们转移4周龄的AI4 CD8+T细胞给NOD.scid.β2mnull.Rip.B7鼠和NOD.scid.Rip.B7鼠时,NOD.scid.Rip.B7组迅速发生糖尿病,NOD.scid.β2mnull.Rip.B7组虽然也有受鼠发病,但发病时间晚,发病率低。7.将CFSE标记的对流感病毒血球凝集素（HA）特异性的CL4 CD8+ T细胞转移到12只选择性地在β细胞上表达HA基因的NOD.scid.Ins.HA鼠内,1×107CL4 CD8+T细胞/受鼠,12只NOD.scid.鼠作为对照。在NOD.scid.Ins.HA受鼠组,转移后第4天,从受鼠胰岛分离到的CL4 CD8+T细胞有高达50%的细胞已经经历了多个循环周期的分化,而从胰腺淋巴结和脾脏分离的CL4 CD8+T细胞却只有少数增殖（图22,23）。转移CL4 CD8+T细胞5天后,由于淋巴细胞严重浸润的胰岛脆性太大,易裂解的缘故,已经无法回收NOD.scid.InsHA受鼠胰岛内的CL4CD8+T细胞。但在NOD.scid对照组,直到转移7天后才在脾脏和PLN首先检测到T细胞增殖（图22,23）,而在胰岛中只发现了少量CL4 CD8+T细胞,细胞数并不随时间的延长而增加。结论1.幼年NOD鼠的脾细胞含有β细胞特异性T细胞,数量有限,但其致糖尿病能力随着NOD鼠年龄的增长而增加。2周龄NOD小鼠的脾细胞可将糖尿病转移到NOD.scid.Rip.B7小鼠中,说明14天龄的NOD鼠的脾细胞含有β细胞特异性T细胞。在NOD.scid受鼠中没有胰岛炎和糖尿病,也说明了在幼年NOD鼠中的T细胞库和/或致糖尿病的T细胞的数量是有限的。转移不同周龄NOD鼠的脾细胞后,4组受鼠糖尿病的发生时间及发病速度明显不同,供鼠周龄越大,受鼠发病越早,发病速度越快,发病率越高。说明T细胞的致糖尿病能力随着NOD供体鼠年龄的增长而增加。NOD.scid.Rip.B7实验组与NOD.scid对照组糖尿病发生率的明显差异表明,共刺激分子CD80在β细胞上的表达促进了静止T细胞对糖尿病的转移诱导,这给我们提供了T细胞与胰岛β细胞直接作用的证据。已发生糖尿病的NOD鼠的脾细胞转移给新生的以及1,2,3,6周龄的NOD.scid鼠,尽管受鼠的年龄不同,但它们发生糖尿病的时间却相似,该结果表明,在胰岛炎启动前,新生的和幼年的NOD.scid鼠就已经表达与疾病有关的β细胞自身抗原。2.β细胞上共刺激分子CD80的表达不影响CD4+T细胞的致糖尿病作用9～10天龄的BDC2.5/NOD.scid鼠的脾细胞转移给6～8周龄NOD.scid.Rip.B7小鼠和NOD.scid小鼠时,在实验组和对照组中观察到的糖尿病的发生率和特点是相同的,并且不论我们转移了多大数量的BDC2.5 CD4+T细胞,在NOD.scid.Rip.B7实验组和NOD.scid对照组所诱导的糖尿病发生率及发病特点都是相似的,该结果证明了β细胞上表达共刺激分子CD80对BDC2.5 CD4+T细胞的致糖尿病能力无影响。3.β细胞上共刺激分子CD80的表达影响了CD8+T细胞的致糖尿病性,并且在淋巴细胞浸润胰岛过程中对静止的CD8+ T细胞发挥了共刺激作用4周龄的NOD.Ragnull.AI4αβTCR转基因鼠的脾细胞（CD8+ T细胞已经活化）诱导NOD.scid.Rip.B7组受鼠糖尿病的快速发生表明,β细胞上共刺激分子CD80的表达增强了β细胞特异性CD8+T细胞的致糖尿病能力。9～10天龄NOD.Ragnull.AI4αβTCR转基因鼠的脾细胞（CD8+ T细胞未被活化）不能将糖尿病转移到NOD.scid受鼠,但对NOD.scid.Rip.B7受鼠诱导的糖尿病的发病率,与4周龄的AI4αβTCR转基因鼠的脾细胞所诱导的糖尿病的发病率相似。这说明,CD8+T细胞与β细胞是直接作用的,而NOD.scid受鼠胰岛炎的低发生率提示共刺激分子CD80在胰岛淋巴细胞浸润过程中对静止的CD8+T细胞发挥了协同刺激作用。4.胰岛炎的启动需要CD8+ T细胞与胰岛β细胞的直接作用。将静止的AI4CD8+T细胞转移到NOD.scid.β2mnull.Rip.B7鼠和NOD.scid.Rip.B7鼠时,NOD.scid.Rip.B7组受鼠被迅速诱发糖尿病,但作为对照,NOD.scid.β2mnull.Rip.B7组受鼠不能被诱导发生糖尿病或胰岛炎。这说明,当NOD.scid.Rip.B7的β细胞失去MHCⅠ类分子的表达,其活化静止CD8+T细胞的能力也随之丧失。也就是说,静止的CD8+ T细胞的活化是因为共刺激分子CD80与表达MHCⅠ类分子的β细胞直接作用的结果。这些结果证明,在胰岛炎的启动中需要β细胞和CD8+T细胞的直接作用。5.静止的CD8+ T细胞在胰岛内与β细胞抗原相遇。将CFSE标记的CL4CD8+ T细胞转移到NOD.scid.Ins.HA和NOD.scid.受鼠内,第4天,从NOD.scid.InsHA受鼠胰岛分离的CL4 CD8+T细胞,有高达50%已经经历了多个循环周期的分化,而从其胰腺淋巴结和脾脏分离的CL4 CD8+T细胞却只有少数增殖;但是在对照组,转移后7天才在受鼠内检测到CL4 CD8+T细胞明显的生理性增殖。这些结果证明,未被免疫的静止CD8+T细胞是直接进入胰岛,在胰岛内与内源性自身抗原相遇并启动胰岛炎,随后CD8+T细胞在胰岛内增殖和扩增。本研究的创新点1.关于CD8+ T细胞在1型糖尿病中的作用及其作用方式的研究,国内至今尚未见有报道;国外虽然有这方面的研究,但尚无定论。本研究利用过继转移的方法,研究发现CD8 T细胞通过与胰岛β细胞直接作用,启动了糖尿病的发生,目前国内外未见报道。2.利用过继转移实验,发现在糖尿病发病过程中,共刺激分子对静止CD8 T细胞的活化依赖于β细胞上表达MHCⅠ类分子。对此国内尚未见报道。3.通过CFSE标记静止的CD8 T细胞,首次发现CD8 T细胞是直接进入胰岛,在胰岛内被活化,而不是在胰腺淋巴结等胰腺外的淋巴器官被活化。第二部分散发性甲旁减自身免疫性发病机制的研究目的特发性甲旁减（idiopathic hypoparathyroidism,IH）分为散发性甲旁减（sporadic idiopathic hypoparathyroidism,SIH）、Di Geoge综合症、家族性1型、家族性2型（autoimmune polyglandular syndrome type 1,APS-1）。关于特发性甲旁减自身抗体方面的研究,主要是针对APS-1中的IH患者。APS-1指Addison病、甲状旁腺机能减退症（甲旁减）和慢性粘膜皮肤念珠菌病三者中至少存在两个,还可伴有其他相关的免疫性疾病。由于组成APS-1的其它内分泌病都是典型的自身免疫病,人们很自然地认为IH也是自身免疫性疾病。而散发性甲旁减患者无家族史,也不伴有APS-1包括的自身免疫性疾病,所以,对APS—1的研究不能代替对散发性甲旁减（SIH）的研究。由于散发性特发甲旁减患者极其罕见,国内外研究甚少,至今病因不明,尚无充分证据说明该病有自身免疫性。本研究,采用间接免疫荧光技术,检测了26例SIH患者血清中的抗甲状旁腺自身抗体,从体液免疫方面探讨SIH的自身免疫性。运用流式细胞技术,分析了10例SIH患者外周血淋巴细胞亚群及调节性T细胞的表达,从细胞免疫方面探讨SIH的自身免疫性。方法1、研究对象:散发性特发甲旁减患者26例及其直系亲属112例和健康对照60例。散发性特发甲旁减患者均无甲旁减、肾上腺皮质功能减退或黏膜皮肤念珠菌感染的家族史,患者本人也不伴有肾上腺皮质功能减退或黏膜皮肤念珠菌感染等自身免疫性疾病,排除APS-1型。所有空腹血清标本采集于1995～2006年间,分装后保存于-80℃待检。部分用于检测钙、磷、镁、全段甲状旁腺激素（iPTH）、FT3、FT4、TSH、血清皮质醇（Cortisol）、TPOAb,其余用于检测抗甲状旁腺自身抗体。另外,采集上述研究对象中10例SIH患者及其38例直系亲属、12例健康对照的新鲜全血,ACD抗凝,分离单个核细胞,用于流式细胞分析。2、抗甲状旁腺抗体的检测:采用间接免疫荧光技术,选用猴子甲状旁腺作底物抗原,用DAPI染核定位甲状旁腺细胞。结果先在荧光显微镜下观察,抗体滴度1:10阳性者,再按1:100稀释重复上述步骤。然后用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行扫描并采集图像。488nm波长的光激发绿色荧光图像（FITC标记的抗体）、356nm波长的光（紫外光,UV）激发蓝色荧光图像（DAPI标记的细胞核）。利用Leica Microsystems Heidelberg GmbH（Leica Confocal Software）分析软件进行图像处理。3、血清钙、血清磷和血清镁含量检测:分别用偶氮砷Ⅲ法、紫外直接沉淀法和二甲苯胺蓝比色法。4、血清FT3、FT4、TSH、Cortisol、TPOAb检测:采用电化学发光免疫分析法,iPTH用双抗体夹心法。5、外周血淋巴细胞亚群的分析:从ACD抗凝的新鲜外周血分离单个核细胞,用荧光标记的抗体染色,洗涤去除未结合的抗体后,应用流式细胞仪进行检测。6、流式细胞分析:用Becton Dickinson FACScalibur流式细胞仪检测,激发光为氩离子激光488nm谱线,使用荧光校准微球校准仪器,调整各荧光补偿。首先检测对照管,建立二维散点图,在散点图上调整参数前向散射光（FSC）及侧向散射光（SSC）,调整阈值,圈定淋巴细胞射门以获取细胞。运行CELLQuest软件（Becton Dickinson,San Jose,CA）采集数据,WinMDI2.8软件分析数据,结果以各细胞亚群占PBMC细胞的百分率表示。6、统计学分析:正态分布或近似正态分布的计数资料均以均数±标准差表示,非正态分布的计数资料以中位数及四分位间距表示。应用SPSS11.0软件进行数据处理,检验水平α=0.05。结果1、一般指标治疗前26例患者血清钙与iPTH水平均明显降低,与直系亲属组及正常对照组比较差异具有统计学意义（P均小于0.01）,血清磷水平明显升高,与直系亲属组及正常对照组比较差异具有统计学意义（P均小于0.05）,以上各指标在直系亲属组与正常对照组之间无显著性差异（P均大于0.05）。3组血清镁比较虽然无显著性差异,但其中4例SIH患者血清镁略低于正常范围;3组FT3,FT4,TSH,Cortisol及TPOAb等均在正常范围,统计学分析无显著性差异（P均大于0.05）。2、抗甲状旁腺抗体26例SIH患者中有10例（8例为女性）患者的血清1:10稀释时抗甲状旁腺抗体阳性,阳性率38.46%,其中3例在1:100稀释时仍呈阳性反应。112例患者直系亲属中有11例血清1:10稀释时抗甲状旁腺抗体阳性,阳性率9.82%,60例正常对照组中有4例血清1:10稀释时抗甲状旁腺抗体呈阳性反应,阳性率6.67%,SIH患者组阳性率明显高于直系亲属组与正常对照组（P均小于0.01）,直系亲属组与正常对照组抗体阳性率无显著性差异（P＞0.05）。抗体阳性的患者与抗体阴性的患者血清钙、磷、镁水平无显著性差异（P均大于0.05）。两组性别、年龄构成无显著性差异,病程及血清iPTH水平比较差异虽无统计学意义,但抗体阴性的患者病程较抗体阳性的患者有延长的趋势,并且其血清iPTH水平较阳性组患者有降低的趋势。3、淋巴细胞表型的检测所测的淋巴细胞亚群中,CD4+,CD8+,CD4+比CD8+比值,CD5+,CD19+,CD5+CD19+等在三组研究对象间结果相似,三组之间比较差异无统计学意义。SIH患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的百分率较健康对照组及患者直系亲属组低,二者比较有显著性差异（P＜0.01）,患者直系亲属组CD4+CD25+调节性T细胞的百分率与健康对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1、散发性特发甲旁减患者体内存在体液免疫功能的改变。本研究中散发性特发甲旁减患者抗体阳性率（38.46%）明显高于亲属组（9.82%）（P＜0.01）及健康对照组（6.67%）（P＜0.01）,提示患者体内体液免疫活化。一般认为,自身抗体在发病中起始动作用的疾病如Grave病和重症肌无力,其临床症状和生化异常的严重程度与血清中抗体阳性程度有关,但我们的研究未发现SIH患者血清中的抗甲状旁腺抗体与该病的临床症状和生化异常的严重程度有关。2、散发性特发甲旁减患者体内存在细胞免疫功能的改变。CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是参与对自身抗原外周耐受的主要T细胞群,也是对外来抗原应答的主要调节性T细胞,对于维持外周免疫耐受有重要意义。有研究表明CD4+CD25+Treg数量减少或功能异常均有可能导致自身免疫病的发生。本研究发现SIH患者外周血中CD4+CD25+T细胞百分比较患者亲属及健康对照组低,提示SIH患者体内免疫调节细胞减少,不能有效的维持自身耐受。患者体内自身免疫稳态破坏,机体更易发生病理性免疫应答,从而激活免疫反应,促使自身免疫性疾病的发生。总之,散发性特发甲旁减患者体内自身反应性抗体的存在以及CD4+CD25+Treg细胞的改变,表明其自身免疫功能的紊乱。本研究的创新点:1、首次对散发性特发甲旁减患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞的表达进行了研究,从细胞免疫学角度探讨疾病的自身免疫发病机制,检索近20年的文献,国内外未见任何报道。2、首次利用流式细胞技术,探讨了散发性特发甲旁减患者外周血中单个核细胞淋巴细胞亚群的表达,检索近20年的文献,国外只有1篇关于特发性甲旁减淋巴细胞亚群的研究报道。3、利用间接免疫荧光技术,对散发性特发甲旁减患者体内抗甲状旁腺自身抗体的存在进行了研究,从体液免疫角度探讨疾病的自身免疫发病机制,至今国内未见任何报道,国外的研究也很少。
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