β-榄香烯脂质体的研究

论文题目: β-榄香烯脂质体的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 药剂学

作者: 王秀敏

导师: 邓英杰,赵春杰

关键词: 热敏脂质体,长循环脂质体,榄香烯,药效学,组织分布和药物动力学

文献来源: 沈阳药科大学

发表年度: 2005

论文摘要: β-榄香烯是从中药温莪术（Curcuma wenyujin Chen et C. Ling）的干燥根茎中提取分离得到的倍半萜烯类化合物。β-榄香烯是具有特异性细胞毒性的广谱抗癌药物，具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒、提高机体免疫力、抑制血小板凝集、改善微循环等作用。其现有制剂，乳注射剂、口服乳等，在临床上主要用于治疗癌性胸腹水、肝癌、肺癌、脑瘤等，疗效确切。近几年来，β-榄香烯已经成为抗癌药物的一个研究热点，也是中药西制的一个典范。β-榄香烯不溶于水，口服生物利用度极低，腹腔注射生物利用度也仅有8.49％，静脉注射可迅速被机体消除。β-榄香烯制剂在临床应用中的一个严重的副作用是血管刺激性较大，静脉炎发生率达30％。基于以上原因，本论文的主要研究目的就是通过脂质体新剂型解决β-榄香烯血管刺激性、提高其生物利用度、延长其静脉注射给药时的体内半衰期，进而靶向肿瘤，提高抗肿瘤疗效。为此我们设计了三种不同类型的脂质体，即β-榄香烯普通脂质体（CLE）、长循环脂质体（PLE）和热敏长循环脂质体（TLLE）。本论文主要包括以下内容：1．β-榄香烯的分离和理化性质测定。温莪术挥发油中分离提取得到了β-榄香烯，并对其理化性质，如油水分配系数、折光率、旋光度、在不同溶剂中的溶解度进行了测定，同时考察了β-榄香烯在乙醇溶液中的稳定性。结果，β-榄香烯油水分配系数为199.5，折光率为1.4932，比旋度为-16.359°，在各种有机溶剂中溶解度均较大。在40℃、60℃加热的条件下，β-榄香烯含量均有所下降。2．CLE、PLE、TLLE的制备及制剂性质考察。乙醇注入法为CLE、PLE的制备方法，在单因素考察和正交试验基础上优化CLE处方。结果表明，脂药比、磷脂浓度、水相介质种类对CLE包封率影响较大，其他因素对包封率影响较小。最后确定CLE的最优处方，得到了包封率较高（92.3％）的CLE；通过考察DSPE-PEG2000的用量，在CLE最优处方的基础上，确定了PLE的处方（包封率95.2％）；以相变温度和包封率为指标，确定了薄膜分散法制备TLLE的处方，该处方相变温度为41.8℃，符合临床热疗的要求，包封率为87.9％；对CLE、PLE和TLLE的理化性质及制剂稳定性进行了考察。结果，CLE、PLE和TLLE为小单室脂质体，CLE、PLE较TLLE稳定，4℃、25℃下12个月内稳定性较好。3．CLE、PLE和TLLE的药物动力学和组织分布的研究。建立了快速、准确、简单的生物样品中p-榄香烯气相色谱分析方法。大鼠尾静脉注射50 mg／kg以上三种制剂后，与市售制剂EE相比，TLLE的t1/2、AUC（0→t）、MRT（0→t）分别为EE的3.2、4.2、2.3倍，统计学分析有显著性差异（P＜0.001）；PLE的t1/2、AUC（0→t）、MRT0→t)分别为EE的2.7、3.9、2.3倍（P＜0.001）；而与EE相比，CLE只使AUC（0→t）提高了1.5倍（P＞0.05），二者其他药动学参数间无显著性差异。药动学结果表明，PLE、TLLE均可使β-榄香烯体内循环时间延长，有长循环性；TLLE、PLE、CLE均可使β-榄香烯生物利用度得到显著提高。荷瘤小鼠尾静脉注射60mg／kg各种制剂，不同方案的组织分布结果表明，各治疗组肿瘤中药物分布由大到小的顺序为：TLLE+HT＞PLE+HT＞PLE＞CLE＞EE+HT＞EE。在热疗条件下，以EE+HT为对照，TLLE+HT有最大的肿瘤靶向性，靶向参数为2.57。在生理温度下，PLE、CLE较EE有更好的肿瘤靶向性（靶向参数分别为2.17、1.33）。TLLE、PLE在肝脾中药物分布量均降低，证明了TLLE、PLE可降低肝脾的摄取，更多地靶向肿瘤组织。尤其是TLLE有在加热部位快速释药的热敏性，使其对肿瘤组织的靶向性大大增加。另外，TLLE、PLE、CLE在脂肪中的分布均减少，有望可以克服EE在脂肪中的蓄积现象。4．CLE、PLE和TLLE药效学研究。在体外抗肿瘤试验中，以EE作为阳性对照药，用MTT试验测定了三种制剂对6种人癌细胞的半数抑制浓度。结果，细胞毒活性为PLE＞CLE≈TLLE＞EE，透射电镜对癌细胞结构的观察结果与MTT试验结果一致。体内药效学试验中，以荷瘤小鼠为动物模型，考察了不同给药方案荷瘤鼠的抑瘤率和生命延长率，结果显示，在40mg／kg剂量下，各组抑瘤效果由强至弱依次为：TLLE+HT（69％）＞PLE+HT（62％）＞CLE+HT（58％）=TLLE（58％）＞PLE（56％）＞EE+HT（51％）＞CLE（48％）＞EE（40％）＞HT（11％）。TLLE+HT组的抑瘤率高达69％。在生理体温（无热疗）条件下，各组比较时，PLE的抑瘤率较高，为56％。生命延长率实验中，生命延长百分率由大到小的顺序为PLE＞CLE＞TLLE。PLE、CLE可使荷瘤鼠存活时间延长约1倍；TLLE使荷瘤鼠存活时间延长约25.7％；EE无延长存活时间的作用。各组荷瘤鼠体重变化的结果表明，在抑瘤实验过程中荷瘤鼠的体重变化未超过正常范围，说明给药剂量比较适合，各种制剂毒副作用均较小。总之，CLE、PLE和TLLE体内外抗肿瘤效果均优于EE。5．CLE、PLE和TLLE的制剂安全性研究。CLE、PLE、TLLE均为静脉注射剂，本文对制剂的安全性从以下几个方面进行了评价。急性毒性实验考察小鼠最大耐受剂量；家兔溶血性试验考察制剂的渗透压是否合格，能否引起溶血；豚鼠的过敏试验考察制剂能否引起过敏反应；家兔的耳缘静脉刺激性试验考察制剂的血管刺激性。结果，三种制剂在制剂最大浓度和小鼠最大耐受剂量下均有良好的耐受性，无溶血现象、无过敏反应发生、对血管无刺激性，静脉给药是安全可行的。

论文目录:

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

第一章：β-榄香烯的分离

1.实验仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

2.实验方法与结果

2.1 柱层析法分离β-榄香烯

2.2 β-榄香烯的薄层色谱分析

2.3 β-榄香烯的气相色谱分析

2.4 β-榄香烯的结构确认

2.4.1 β-榄香烯的GC-MS分析

2.4.2 紫外光谱

2.4.3 红外光谱

2.4.4 核磁共振光谱(NMR)

2.4.4.1 β-榄香烯的~1H-NMR谱

2.4.4.2 β-榄香烯的~(13)C-NMR谱

3.讨论

本章小结

参考文献

第二章：β-榄香烯体外分析方法的建立及理化性质的研究

第一节：β-榄香烯体外方法的建立

1.仪器及材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

2.实验方法

2.1 色谱条件的选择

2.2 标准曲线的绘制

2.3 分析方法的确证

2.3.1 精密度试验

2.3.2 回收率试验

3.结果

3.1 β-榄香烯的标准曲线

3.2 日间和日内精密度

3.3 回收率

4.讨论

第二节：β-榄香烯处方前基本理化性质的测定

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

2.实验方法

2.1 β-榄香烯比旋度的测定

2.2 β-榄香烯折光率的测定

2.3 β-榄香烯在各种溶剂中溶解度的测定

3.实验结果

3.1 旋光度和比旋度的测定结果

3.2 折光率的测定结果

3.3 溶解度的测定结果

4.讨论

第三节：β-榄香烯油水分配系数的测定

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

2.实验方法

2.1 色谱条件的选择

2.2 标准曲线的绘制

2.3 分析方法的确证

2.3.1 精密度试验

2.3.2 回收率试验

2.4 油水分配系数的测定

3.实验结果

3.1 油水分配系数测定的标准曲线

3.2 日间、日内精密度结果

3.3 回收率结果

3.4 油水分配系数的测定结果

4.讨论

第四节：β-榄香烯原料药稳定性考察

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

2.实验方法

2.1 加速试验

2.2 室温留样试验(长期试验)

3.实验结果

3.1 加速试验结果

3.2 长期试验结果

4.讨论

本章小结

参考文献

第三章：CLE、PLE、TLLE的制备和性质考察

第一节 CLE、PLE的制备及包封率的测定

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

2.实验方法与结果

2.1 CLE包封率测定方法的建立

2.1.1 GC法测定CLE中总药量

2.1.1.1 方法专属性考察

2.1.1.2 乙醚萃取回收率的考察

2.1.2 葡聚糖凝胶(SephadexG-50)微柱离心法对脂质体和游离药物的分离

2.1.2.1 葡聚糖凝胶柱的制备

2.1.2.2 葡聚糖凝胶柱对空白脂质体吸附作用考察

2.1.2.3 葡聚糖凝胶柱对β-榄香烯吸附作用考察

2.2 CLE的制备

2.2.1 CLE制备方法的选择

2.2.2 处方筛选

2.2.2.1 磷脂量(浓度)对包封率的影响

2.2.2.2 介质种类及离子强度对包封率的影响

2.2.2.3 磷脂与胆固醇比例对包封率的影响

2.2.2.4 脂药比对包封率的影响

2.2.2.5 挤出比对包封率的影响

2.2.3 正交试验优化CLE处方

2.3 PLE处方的确定

3.讨论

第二节：β-榄香烯热敏长循环脂质体(TLLE)的制备

1.仪器与药品

2.方法

2.1 TLLE制备方法的确定

2.2 TLLE处方的筛选

2.3 TLLE热敏性和长循环性的初步评价

3.讨论

第三节：CLE、PLE、TLLE理化性质及稳定性的研究

1.仪器与药品

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

2.方法

2.1 CLE、PLE、TLLE形态的观察

2.2 CLE、PLE、TLLE粒径的测定

2.3 CLE、PLE中乙醇残留量的测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

2.3.1.1 色谱条件

2.3.1.2 溶液的配制

2.3.2 系统适应性试验

2.3.2.1 柱效的测定

2.3.2.2 分离度

2.3.2.3 校正因子的测定

2.3.2.4 回收率实验

2.3.2.5 精密度实验

2.3.3 CLE、PLE中乙醇残留量的测定

2.4 CLE、PLE、TLLE稳定性考察

2.4.1 脂质体膜的化学稳定性

2.4.1.1 膜材的过氧化值(POV)的测定

2.4.1.2 脂质体的pH值

2.4.2 物理稳定性

2.4.3 影响因素试验

2.4.4 留样观察试验

3.讨论

本章小结

参考文献

第四章：药物动力学和组织分布的研究

第一节：药物动力学研究

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

2.方法与结果

2.1 体内血药浓度分析方法的建立

2.1.1 血浆样品分析方法

2.1.1.1 色谱条件

2.1.1.2 血浆样品处理方法

2.2 分析方法确证

2.2.1 方法专属性考察

2.2.2 标准曲线和线性范围

2.2.3 精密度与准确度

2.2.4 萃取回收率

2.3 CLE、PLE、TLLE大鼠尾静脉注射的药物动力学研究

2.3.1 给药方案及血样采集

2.3.2 数据处理

2.3.3 药动学实验结果

3.讨论

第二节：组织分布的研究

1.仪器与药品

2.方法

2.1 组织样品分析方法的建立

2.1.1 组织样品分析方法

2.1.1.1 色谱条件

2.1.1.2 组织样品处理方法

2.1.2 分析方法确证

2.1.2.1 方法专属性确证

2.1.2.2 标准曲线制备

2.1.2.3 精密度、准确度

2.1.2.4 萃取回收率

2.2 组织分布研究

2.2.1 血浆及组织样品的制备

2.2.2 靶向性评价

2.2.3 统计学处理

2.2.4 组织分布的结果

2.2.4.1 非热疗组的组织分布结果

2.2.4.2 热疗组的组织分布结果

2.2.4.3 热疗组和非热疗组的组织分布比较

3.讨论

本章小结

参考文献

第五章：体内外药效学研究

第一节：体外抗肿瘤试验

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 细胞系

2.实验方法

2.1 MTT试验的基本原理

2.2 试液的配制

2.2.1 RMP11640培养液配制

2.2.2 PBS配制

2.3 癌细胞的培养

2.4 MTT试验的过程

2.5 癌细胞形态变化的观察

3.结果

3.1 MTT试验结果

3.2 CoCl在同药物作用后的形态变化

4.讨论

第二节：体内抗肿瘤实验

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

1.4 瘤株

2.方法与结果

2.1 瘤细胞(H22)接种方法

2.2 用药剂量的确定

2.3 抑瘤实验方法和结果

2.4 组织学检查

2.5 体重变化的考察

3.讨论

第三节：生命延长百分率试验

1.仪器与材料

2.方法与结果

3.讨论

本章小结

参考文献

第六章：制剂安全性评价

第一节：急性毒性考察

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第二节：体外溶血性试验

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

2.实验方法

3.实验结果

4..讨论

第三节：过敏试验

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

第四节：血管局部刺激性试验

1.仪器与材料

1.1 仪器

1.2 药品与试剂

1.3 实验动物

2.实验方法

3.实验结果

4.结论

5.讨论

本章小结

参考文献

全文结论

致谢

作者简介

发布时间: 2006-12-14

参考文献

[1].多功能纳米聚联乙炔脂质体的制备、结构、性质及功能研究[D]. 严晓娟.华东理工大学2014
[2].胆固醇衍生物脂质体作为药物载体的研究[D]. 杨斌.上海交通大学2011
[3].体温敏感吲达帕胺缓释脂质体凝胶剂的研究[D]. 索绪斌.沈阳药科大学2005
[4].多肽修饰的脂质体靶向肿瘤输送过程的研究[D]. 唐海玲.上海交通大学2014
[5].基于热敏脂质体及低密度脂蛋白模型的纳米载体靶向药物递送系统研究[D]. 李明媛.中国人民解放军军事医学科学院2017
[6].靶向于雌激素受体的长循环米托蒽醌脂质体及其抗肿瘤研究[D]. 郝强.吉林大学2017
[7].银杏叶提取物前体脂质体的构建、评价及其肠吸收机理的研究[D]. 郑彬.吉林大学2016
[8].5-氟尿嘧啶高分子前体药物及脂质体的研究[D]. 郝爱军.沈阳药科大学2005
[9].口服天然黄体酮给药系统的设计[D]. 王梅.新疆医科大学2008
[10].胆固醇—半乳糖苷配体修饰紫杉醇脂质体的制备及其抑制HepG2肿瘤细胞的研究[D]. 郑品劲.广州中医药大学2016

β-榄香烯脂质体的研究

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