人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究

人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究

论文摘要

第一章人胚胎干细胞(hESCs)向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究目的:体外模拟胰腺的体内发育过程,通过添加因子的方式诱导hESCs得到胰岛素分泌细胞。方法:HESCs在人源性饲养层培养体系下传代培养,在传代第5天开始诱导实验,分四个阶段。第一阶段,hESCs在高浓度的ActivinA(100ng/ml)和低浓度血清条件下作用5天向限定性内胚层(DE)细胞特化;第二阶段,先由视黄酸(10-5M)处理24小时以启动胰腺命运特化,第三阶段,加入1%ITS和Fibronectin(5ug/ml)以及Exendin-4(50ng/ml)的作用7天,促进胰腺前体细胞的增殖和分化;第四阶段,将细胞消化后悬浮培养,加入1%N2,2%B27,烟碱(10-2M),Exendin-4(50ng/ml)以及Betacellulin(20ng/ml)作用7天使细胞进一步分化成熟得到胰岛样细胞团。结果:诱导过程中能检测到胰腺发育关键转录因子(Sox17,Pdx1,Ngn3,Beta2)的表达,第5天有80%左右的Sox17阳性细胞,第13天有17%左右的Pdx1阳性细胞,第20天有4%左右的胰岛素(Insulin)阳性细胞。诱导终末团块表达胰岛细胞标记蛋白Insulin和胰高血糖素(Glucagon);胰腺细胞的特征基因Insulin,Glucagon,生长抑素(Somastatin,SS),淀粉酶(Amylase);分泌功能相关的标记基因PC2,PC1/3,SUR1,GCK;胰岛素释放实验显示,终末细胞团对不同糖浓度(5.5mM和25mM)具有反应性,在高浓度条件下的胰岛素释放量是低浓度条件下的1.5—4倍。电镜检测到胞浆中存在大量分泌性颗粒。结论:四阶段诱导法诱导所得终末细胞团具备胰岛细胞的基本特征。第二章人孤雌胚胎干细胞(phESCs)和正常hESCs向胰岛素分泌细胞诱导分化的比较研究目的:探究phESCs能否向胰岛素分泌细胞分化以及它与正常hESCs在分化过程中是否存在差异。方法:以正常来源的hESCs(chHES8),孤雌来源的hESCs(chHES32,chHES69)共三株细胞为材料,在分化的d0,d5,d13,d20收集细胞,通过RT-PCR,realtime PCR以及免疫荧光染色来比较它们的胰腺发育标记蛋白(Sox17,Pdx1,Insulin)阳性率,胰腺发育标记基因和印记基因的表达水平,以及增殖能力上的差异。结果:在诱导过程中,phESCs来源的细胞能表达胰腺发育各个阶段的标记基因和蛋白,终末细胞团对不同葡萄糖浓度刺激呈现反应性。与正常hESCs来源的细胞相比,phESCs来源的细胞Sox17的基因和蛋白表达量与它的表达水平相近;phESCs来源的细胞Insulin蛋白表达水平是它的1/2左右;三株细胞的增殖能力没有统计学差异。大部分印记基因呈现典型的父源性或母源性表达,只有IGF2/H19这对印记基因在2株phESCs的体外分化过程中出现了逐渐增强的表达,与正常hESCs表达水平接近。结论:phESCs具有分化为胰岛素分泌细胞的能力,正常hESCs较phESCs更容易向胰岛素分泌细胞诱导分化。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 英文缩写注解
  • 技术路线
  • 前言一
  • 第一章 人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究
  • 1 材料与试剂
  • 1.1 细胞
  • 1.2 试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2 方法
  • 2.1 细胞培养
  • 2.2 hESCs的分化
  • 2.3 免疫组化
  • 2.4 RNA的抽提、纯化
  • 2.5 RT-PCR检测
  • 2.6 胰岛素释放实验
  • 2.7 电镜检测实验
  • 3 结果
  • 3.1 hESCs的分化
  • 3.2 RT-PCR检测基因表达结果
  • 3.3 免疫荧光染色结果
  • 3.4 胰岛素释放结果
  • 3.5 电镜检测结果
  • 4. 讨论
  • 前言二
  • 第二章 人孤雌胚胎干细胞和正常胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的比较研究
  • 1. 材料和试剂
  • 1.1 细胞
  • 1.2 试剂
  • 1.3 主要仪器
  • 2. 方法
  • 2.1 细胞培养
  • 2.2 免疫组化
  • 2.3 RNA的抽提
  • 2.4 RT-PCR检测
  • 2.5 relatime PCR检测标记基因的差异
  • 2.6 胰岛素释放实验
  • 3. 结果
  • 3.1 hESCS的培养
  • 3.2 免疫染色结果
  • 3.3 RT-PCR结果
  • 3.4 realtime PCR结果
  • 3.5 胰岛素释放结果
  • 4. 讨论
  • 总结
  • 附图
  • 参考文献
  • 综述
  • 致谢
  • 个人简历
  • 相关论文文献

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