论文摘要
目的 观察由人甲胎蛋白（AFP）启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因（HSV-Ⅱ-tk）与血管生成抑制素基因（Angio）的融合基因对人肝细胞性肝癌的体外治疗作用。方法 通过PCR技术,从临床肝癌标本中克隆AFP启动子;通过基因重组技术,构建的真核表达载体pcDNA3/AFP/tk/Angio;通过阳离子脂质体Liofectamine介导,体外转染人肝细胞性肝癌细胞株SMMC—7721和Bel7402。加入GCV,细胞培养。用RT—PCR,光镜,透射电境,MTT,流式细胞仪等方法检测HSV-Ⅱ-tk和Angiostatin基因在SMMC-7721和Bel 7402细胞中的表达及其对该细胞的杀伤作用。结果 1.获得人甲胎蛋白（AFP）启动子300bp;2.经测序证实AFP启动子正确插入pcDNA3/tk/Angio;3.表达AFP的Bel 7402细胞通过RT—PCR获得与目的基因（HSV-Ⅱ-tk）大小一致（1100bp）的特异性条带,SMMC-7721细胞则无任何条带出现;MTT法检测显示,Bel 7402实验组的OD570值明显低于对照组,且有显著意义（P<0.05）,Bel 7402实验组OD570值明显低于SMMC 7721实验组,且有显著意义（P<0.05）;SMMC-7721各组OD570值无明显差异（P>0.05）;流式细胞仪检测显示,Bel 7402实验组出现明显的凋亡峰,而对照组及SMMC—7721各组则未出现凋亡峰;透射电境观察Bel 7402实验组细胞可见凋亡小体。结论 克隆获得AFP启动子;成功构建的真核表达载体pcDNA3/AFP/tk/Angio;通过阳离子脂质体Liofectamine介导,HSV-Ⅱ-tk在表达AFP的Bel 7402细胞中能够获得表达,其表达产物结合GCV可诱导人肝细胞性肝癌细胞的凋亡。
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