PDGF-C和TGF-β1的基因克隆原核表达及特异多克隆抗体的制备

论文摘要

目的：血小板衍生因子C（PDGF-C）和转化生长因子β1（TGF-B1）是乙型肝炎病毒所导致的肝纤维化的分子病理机制中的重要细胞因子。目前对这两种细胞因子还缺乏有效的检测方法,本研究的目的是克隆人的PDGF-C和TGF-B1的部分编码基因、原核表达蛋白,制备特异性的PDGF-C、TGF-β1多克隆抗体,为建立这两种细胞因子的有效检测方法提供可靠的前提保障。方法：经生物信息学分析,选择出要扩增的人TGF-β1和PDGF-C编码基因片段。通过RT-PCR的方法扩增选择的人TGF-β1和PDGF-C的编码基因,经限制性内切酶EcoRI和Xhol双酶切扩增的目的产物及质粒（pGEX-5X1及pRSET-A2）,（?）将经酶切回收的扩增产物及质粒用T4DNA ligase连接酶体外连接组成重组质粒。将重组质粒转化入基因工程克隆菌E.coli XL1-blue进行扩增,将提取的重组质粒进行酶切鉴定及基因测序,明确重组质粒是否正确。将验证正确的重组质粒转化入基因工程表达菌E.coli BL-21或者E.coli BL-21（DE3）,在原核细菌中诱导表达出含TGF-β1和PDGF-C部分片段的融合蛋白（带有GST标签）,经切胶回收的方法分别纯化出融合蛋白（带有GST标签）。用上述纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备出相应的TGF-β1和PDGF-C多克隆抗体。用含TGF-β1和PDGF-C片段相同,但带HIS标签的融合蛋白,进行ELISA及Western blot检测,并通过检测HepG2细胞内源性表达的PDGF-C和A549细胞中内源性表达的TGF-β1,结合文献报道以明确多克隆抗体是否制备成功。采用Western blot的方式,用制备的抗体检测正常人和肝硬化病人的血清中的PDGF-C和TGF-β1,初步探讨其的应用价值和制备效果。结果：1RT-PCR成功扩增了目的PDGF-C和TGF-β1编码基因片段；2.经基因测序验证,成功构建了pGEX-5X1/PDGF-C重组质粒、pRSET-A2/PDGF-C重组质粒、pGEX-5X1/TGF-β1重组质粒、pRSET-A2/TGF-β1重组质粒；3.转化有重组质粒的E.coli BL-21菌,诱导表达出了条带位置正确的含TGF-β1和PDGF-C部分片段的融合蛋白；4.分别纯化出了TGF-β1、PDGF-C的融合蛋白；5.分别制备了抗TGF-β1、 PDGF-C的兔多克隆抗体；6.使用制备的抗体,对表达的带有HIS标签的PDGF-C、TGF-β1融合蛋白及真核细胞内源性的PDGF-C和TGF-B1蛋白,通过Western blot的方法检测出了目的条带；7.用所制备的抗体进行Western blot检测,发现肝硬化病人血清中的PDGF-C前体和TGF-β1前体含量和正常人有明显差异。结论：成功制备出了特异性的抗人TGF-β1和PDGF-C的兔多克隆抗体,用所制备的抗体对乙肝病毒感染的肝硬化病人和正常人血清中的Western blot检测显示TGF-β1和PDGF-C在肝硬化病人和正常人血清中差异明显,表明制备的抗体对乙型肝炎病毒所导致的肝纤维化的分子病理机制的研究有重要价值,并对建立有效的TGF-β1和PDGF-C的检测方法提供了前提保障。其中对PDGF-C的基因克隆和原核表达及多克隆抗体制备国内外未见他人报道；TGF-β1的基因克隆和原核表达及多克隆抗体制备国内已有人报道,但未见与本文TGF-β1的编码基因部分选取相同的基因克隆和原核表达及多克隆抗体制备。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述 PDGF-C和TGF-ifl的生物学功能及在肝纤维化发生中的作用
• 综述参考文献
• 致谢