论文摘要
一研究目的:为探索一种新的免疫毒素治疗胰腺癌的方法,通过SPDP化学偶联法,我们将眼镜蛇毒细胞毒素（CTX）与抗IL-4R单克隆抗体（MAIL4R）构建成免疫毒素MAIL4R-CTX,观察其是否具有导向性杀伤胰腺癌细胞的作用。二材料与方法1.眼镜蛇毒细胞毒素的分离纯化:先采用SP-Sephadex C-25离子交换柱层析、再用Superdex 75凝胶过滤及Phenyl- Sepharose High Performance疏水层析两步从舟山眼镜蛇粗毒中精细纯化分离CTX。2.免疫毒素的制备:应用SPDP偶联法,在室温下,先将CTX与SPDP反应生成CTX-PDP;再将MAIL4R与SPDP反应生成MAIL4R-PDP,后者在DTT的作用下还原为MAIL4R-SH;最后CTX-PDP与MAIL4R-SH在室温下充分反应至少24小时后,生成抗白介素4-受体单抗-细胞毒素免疫毒素（MAIL4R-CTX）。3.采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向免疫扩散和免疫斑点试验检测免疫毒素的组成。4.采用免疫组织化学染色检测胰腺癌组织中IL-4R的表达。采用免疫细胞化学染色检测体外培养人胰腺癌细胞株PANC-1、BxPC-3中IL-4R的表达。5.采用DAB法检测免疫毒素MAIL4R-CTX对高表达IL-4R细胞BxPC-3、PANC-1和不表达IL-4R人肺腺癌细胞H1299的结合能力。6.采用MTT法分别测定CTX、MAIL4R及MAIL4R-CTX对体外培养胰腺癌细胞和肺癌细胞的作用。三结果1.眼镜蛇毒粗毒的SP-Sephadex C-25柱层析分离共得14个蛋白峰;组分XIII鉴定为细胞毒素,再经Superdex 75凝胶过滤和Phenyl-Sepharose HP疏水层析获得单一对称蛋白峰,测其分子量为:77.381kDa。将其命名为CTX。2.CTX与SPDP反应物经Superdex30凝胶柱后获得的第一峰为CTX-PDP;MAIL4R与SPDP反应物经Superdex30凝胶柱获得的第一峰为MAIL4R-PDP;MAIL4R-PDP经DTT还原后再经凝胶柱获得的第一峰为MAIL4R-SH;最后将过量的CTX-PDP与MAIL4R-SH反应物经Superdex30凝胶过滤,获得2个蛋白峰,第一峰即为免疫毒素MAIL4R-CTX。3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向免疫扩散和免疫斑点试验显示该免疫毒素分子中既含有CTX也含有MAIL4R。4.免疫组织化学染色显示在胰腺癌细胞中,细胞质呈现均匀着色的棕黄色颗粒,而正常胰腺组织细胞均为阴性着色。免疫细胞化学显示在胰腺癌PANC-1、BxPC-3细胞中,细胞质呈现棕黄色颗粒着色,而H1299细胞为阴性着色。5.高表达IL-4R的BXPC-3和PANC-1细胞DAB染色为棕色,而不表达IL-4R细胞H1299则未被染色。6.采用MTT法观察到,MAIL4R-CTX在1.2 ug/ml时即明显抑制PANC-1、BxPC-3细胞的生长,在浓度为18.75ug/ml作用4h时PANC-1和BxPC-3细胞分别有86.4%和95.2%被杀伤,H1299细胞仅为26.8%;CTX对PANC-1,BxPC-3和H1299细胞均有明显抑制作用,在浓度为8ug/ml时对三株细胞的抑制率分别达到88.5%,87.2%和90%,但三者无明显差别;MAIL4R对PANC-1、BxPC-3和H1299细胞均无明显抑制作用。四结论1.采用SP-Sephadex C-25阳离子交换柱层析、Superdex 75凝胶过滤及Phenyl-Sepharose HP疏水层析三步分离纯化可得到低毒高效的眼镜蛇毒细胞毒素（CTX）纯品。2.以SPDP法可以成功地将抗白介素-4受体单克隆抗体（MAIL4R）与CTX构建成免疫毒素MAIL4R-CTX。3.胰腺癌组织和胰腺癌细胞高表达IL-4R,正常胰腺组织不表达IL-4R。免疫毒素MAIL4R-CTX对高表达IL-4R的胰腺癌细胞具有选择性杀伤作用。
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