论文摘要
原发性肝细胞癌（HCC）是临床常见恶性肿瘤,目前手术切除仍是最有效的治疗方法,然而大部分患者就诊时失去手术切除机会,而非手术姑息性治疗方法,包括经导管动脉内化疗栓塞（TACE）、射频消融、放射治疗等,疗效均不满意。分子靶向药物的应用是近年肿瘤领域的突破性进展,sorafenib是目前唯一经Ⅲ期临床试验证实疗效并被FDA批准用于晚期肝癌患者的小分子蛋白激酶抑制剂。然而两项Ⅲ期临床试验包括西方的SHARP研究和东方的ORIENTAL研究均发现sorafenib治疗组生存期仅延长了不足3个月。另一方面,大量研究报道了分子靶向药物治疗肿瘤的负面作用,包括直接和间接的促肿瘤侵袭转移及抑制肿瘤免疫的不利影响。我们前期研究发现,小剂量sorafenib可直接作用于肝癌细胞本身下调抑癌基因HTATIP2的表达,诱导EMT,增加肝癌细胞的侵袭及转移能力。小分子靶向药物还可能影响机体的抗肿瘤免疫功能。是否sorafenib同样可作用于机体免疫功能从而影响其疗效需要进一步探讨。本文用一种预处理模型即先用sorafenib预处理小鼠,然后接种肿瘤,观察其对肿瘤生长转移能力的影响,并从机体免疫中的自然杀伤细胞（NK）方面探讨其治疗肝癌可能的不足之处,并探索提高疗效的途径。1. Sorafenib预处理小鼠诱导其肝癌生长转移潜能增强我们首先对无瘤裸小鼠经sorafenib预处理两周后停药,然后接种各种肝癌模型,观察肿瘤的生长、转移及裸小鼠生存情况,这样可以最大程度体现sorafenib对裸小鼠造成的体内效应对肿瘤生物学功能的影响。结果显示裸小鼠经sorafenib预处理（30mg/kg,60mg/kg2周）后皮下成HCCLM3肿瘤生长速度加速,肿瘤体积及重量增加；sorafenib预处理（60mg/kg2周）后裸鼠经尾静脉注射HepG2-GFP肝癌细胞后肺转移（肺转移灶体积／总肺体积）增加,荷瘤裸小鼠生存期明显缩短；sorafenib预处理（60mg/kg2周）后裸鼠肝脏原位成LM3-RFP肿瘤,原位瘤无明显改变,但肺转移数目明显增多。为进一步在免疫正常小鼠中验证此现象,sorafenib预处理（60mg/kg2周）C57BL/6小鼠后停药,尾静脉注射小鼠肝癌细胞Hepal-6-GFP,同样发现肺转移形成能力（肺转移灶体积／总肺体积）较对照组明显增强。2. Sorafenib抑制NK细胞免疫介导其促生长及转移负面作用我们用不同剂量sorafenib （30mg/kg,60mg/kg2周）干预C57BL/6荷瘤及无瘤小鼠,从机体免疫方面探讨其可能的负面作用。流式监测结果发现sorafenib显著降低荷瘤及无瘤小鼠外周血及脾脏NK细胞的比率,其中以60mg/kg组降低最为明显,而CD4+及CD8+T细胞比率改变不明显。Sorafenib显著下调荷瘤小鼠NK细胞表面活化标记CD69的表达及杀伤靶细胞（Yac-1）的能力。体外实验中,sorafenib浓度依赖性的抑制健康人NK细胞的活性及杀伤功能。应用中和NK1.1抗体某种程度去除C57BL/6小鼠NK细胞后,sorafenib预处理（60mg/kg2周）介导的促肝癌转移的潜能消失。3. Sorafenib阻断AKT及ERK磷酸化是其抑制NK细胞免疫的重要机制为探讨sorafenib对NK细胞的影响,我们培养永生型细胞系NK92-MI细胞观察增殖功能,分选健康人及小鼠NK细胞研究其功能,并进一步探索机制。Sorafenib浓度依赖性的抑制NK-92MI的增殖,72小时5uM抑制率大于50%,而10uM时几乎达100%,此抑制效应同PI3K/AKT通路抑制剂LY294002类似。Western blot证实了sorafenib作用12小时可以降低AKT磷酸化水平。体外实验证实Raf/MEK/ERK磷酸化通路抑制剂PD98059及U0126同样显著降低NK细胞杀伤活性及IFN-γ分泌,western blotting证实sorafenib短时间干预能够抑制ERK的磷酸化水平。为此我们推测sorafenib长时间作用抑制NK细胞增殖跟阻断AKT磷酸化有关,而短时间作用阻断ERK磷酸化通路介导了NK细胞功能的降低。4.中药小复方“松友饮”联合sorafenib协同治疗肝癌作用跟其间接调节NK细胞免疫功能有关本部分工作的主要目的是在不同转移潜能的人肝癌裸鼠模型中,探索含5味中药的小复方“松友饮”联合sorafenib治疗是否存在协同作用,并探索其机制。首先在我们所高转移人肝癌裸鼠原位模型（LM3-RFP）中,发现sorafenib （30mg/kg/day）用药四周抑制原位肿瘤的大小,减少肺转移绝对数目,但如果将肺转移标准化后（肺转移数目/肿瘤体积）,小剂量sorafenib反而可以增加相对肺转移数目；低剂量单用松友饮（2g/kg）未能减小肿瘤大小,但确可明显降低绝对肺转移的数目；而两药联合治疗可进一步抑制肿瘤的大小,而且降低绝对肺转移的发生,将肺转移进行标准化后,联合治疗组相对肺转移数量跟对照组差异不明显,从而逆转了sorafenib的促转移作用。并且,联合治疗较单独用药更加显著延长荷瘤小鼠的生存期。在低转移人肝癌裸鼠原位模型（HepG2-GFP）中联合治疗同样可协同抑制肿瘤的生长,进一步延长小鼠生存期。为研究其协同作用的可能机制,我们首先将两药单独或联合体外作用于肿瘤细胞,发现两者联合并未协同抑制肿瘤细胞的生长及侵袭能力。结合前期sorafenib抑制NK细胞免疫的研究发现,我们从NK细胞方面探讨两药协同抗肿瘤的机制。在C57BL/6小鼠原位肝癌模型（Hepal-6）中,松友饮（2g/kg4周）可以一定程度上弥补sorafenib引起的NK细胞比率及杀伤功能的降低。两药单用或联合预处理裸鼠两周后停药尾静脉注射HepG2-GFP肝癌细胞,联合组较sorafenib组NK细胞比率明显提高,肺转移形成能力（肺转移灶体积／总肺体积）显著降低,松友饮可以减弱sorafenib的促转移潜能。虽然松友饮并未直接影响分选C57BL/6小鼠NK细胞的活性,但松友饮治疗组小鼠血浆显著增加了NK细胞的杀伤功能。ELISA监测发现松友饮组小鼠血浆NK细胞相关的因子IFN-γ及MCP-1明显提高,提示松友饮可能经体内代谢间接作用于NK细胞或其它免疫细胞而发挥调节作用。结论1. Sorafenib预处理裸小鼠和正常小鼠诱导其肝癌生长转移潜能增强。2. Sorafenib抑制NK细胞免疫是其促生长及转移重要机制,并且与阻断NK细胞AKT及ERK磷酸化通路有关。3.中药小复方“松友饮”可以进一步增强sorafenib的肝癌治疗效果,并且可能跟间接上调NK细胞的功能有关。应用价值1.动物实验及细胞实验均发现sorafenib治疗肝癌的同时具有抑制机体NK细胞免疫的负面作用,提示我们应当关注并监测应用sorafenib的晚期肝癌患者的免疫功能。2.发现应用中药小复方“松友饮”可以一定程度上弥补sorafenib抑制NK细胞免疫的不足之处,进一步加强了sorafenib治疗肝癌的疗效,同时也为联合其它免疫增强药物提供理论基础。创新点1.首次在动物实验及体外实验发现并验证sorafenib能够显著抑制NK细胞免疫的负面作用,丰富了sorafenib临床治疗肝癌疗效欠佳的机制研究。2.首次发现中药小复方“松友饮”能够弥补sorafenib抑制NK细胞的不足,联合干预能进一步增强sorafenib疗效,使两者联合应用转化于临床成为可能。