牛白血病间接ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

论文摘要

地方流行性牛白血病（Enzootic Bovine leukosis,EBL）是由牛白血病病毒（Bovine leukemia virus,BLV）引起的以淋巴细胞持续性增生为特征的传染性肿瘤性疾病,主要发生于4～8岁的成年牛。该病几乎遍布全世界各养牛国家,在我国某些牛群中血清阳性率达30%～50%,已成为牛的重要传染病之一。目前我国使用的牛白血病检测试剂几乎全部来自国外,价格昂贵,检测成本很高。因此自主研发高水平的检测试剂盒对该病的防制具有重要意义。本研究在原有的研究基础之上展开,将已构建并经鉴定正确的PET-32a-gp51表达菌株复苏,在大肠杆菌BL21中大量诱导表达,通过纯化及复性后得到纯度高、免疫学活性好的gp51重组蛋白,参照已建立的间接gp51-ELISA方法,以此重组蛋白研制了检测牛白血病病毒抗体的间接gp51-ELISA试剂盒,并进行了试剂盒的评价及初步应用研究。主要内容如下:1.gp51重组蛋白的大量制备与纯化将本实验室已构建成功的含PET-32a-gp51表达载体的菌株复苏,在大肠杆菌BL21中大量诱导表达,收集菌体经超声波破碎,将包涵体通过Ni2+亲和层析柱进行纯化,透析复性后用PAGE电泳检测,得到纯度较高的gp51重组蛋白。紫外光分光光度计检测,重组蛋白浓度为0.216mg/mL。2.试剂盒的制备及评价利用纯化的gp51重组蛋白作为包被抗原研制了gp51-ELISA诊断试剂盒,试剂盒主要成分包括:已包被抗原的96孔板、HRP标记的兔抗牛IgG和牛白血病阴性、阳性标准血清。对试剂盒进行了特异性、灵敏度、重复性及保存期试验,结果表明:试剂盒能特异地检测牛白血病阳性标准血清,与牛传染性鼻气管炎、蓝舌病、牛病毒性腹泻和赤羽病等阳性标准血清均无交叉反应;用该试剂盒对牛白血病阳性标准血清进行检测,测定效价为1:256～1:512,灵敏度是AGIDT的4～8倍;重复性试验,试剂盒批内差异为1.35%～4.11%,批间差异为3.49%～9.54%,分别小于10%和15%;保存期试验,试剂盒-20℃保存期为6个月,4℃保存期为1个月。与法国Synbiotics公司同类试剂盒进行比对试验,诊断敏感性、特异性和符合率分别为75%、96.1%和94.6%。3.试剂盒的初步应用对采集于山东济南的164份奶牛血清和进口澳大利亚奶牛的398份血清进行检测,BLV抗体阳性率分别6.10%和4.77%。试验结果表明,gp51-ELISA试剂盒具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点,其检测效果与进口试剂盒相当,且价格低廉,可满足我国奶牛场、兽医站、屠宰场及口岸检疫EBL检测的实际需要,这为大范围调查我国EBL流行情况提供了一个较理想的工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（ABBREVIATION）
• 1 文献综述
• 1.1 EBL的发现及研究历史
• 1.2 EBL病原学特征
• 1.2.1 病原的分类和命名
• 1.2.2 BLV的形态结构
• 1.2.3 BLV的理化特征
• 1.3 BLV的分子生物学特征
• 1.3.1 病毒基因组的结构及其表达产物的功能
• 1.3.2 病毒的反转录特征
• 1.4 牛白血病的流行病学特征
• 1.4.1 易感动物及潜伏期
• 1.4.2 感染率和发病率
• 1.4.3 传播途径
• 1.5 牛白血病的临床症状及其病理变化
• 1.5.1 临床症状
• 1.5.2 病理变化
• 1.6 牛白血病感染的免疫学
• 1.6.1 体液免疫
• 1.6.2 细胞免疫
• 1.7 牛白血病诊断方法的研究进展
• 1.7.1 病毒的分离鉴定
• 1.7.2 临床血液学检查
• 1.7.3 电子显微镜检测
• 1.7.4 合胞体感染性测定
• 1.7.5 动物试验
• 1.7.6 放射免疫测定
• 1.7.7 聚合酶链式反应
• 1.7.8 琼脂凝胶免疫扩散试验
• 1.7.9 酶联免疫吸附试验
• 1.8 牛白血病的防制
• 1.8.1 药物治疗
• 1.8.2 疫苗防制
• 1.8.3 综合防制措施
• 1.9 牛白血病的公共卫生学意义
• 1.10 研究的目的和意义
• 2 试验材料
• 2.1 主要试剂
• 2.2 主要溶液的配制
• 2.2.1 表达菌复苏相关溶液
• 2.2.2 SDS-PAGE电泳相关溶液
• 2.2.3 蛋白纯化相关溶液
• 2.2.4 ELISA相关溶液
• 2.3 标准血清、样品血清和对比试剂盒
• 2.4 主要仪器与设备
• 3 试验方法
• 3.1 GP51重组蛋白的制备及纯化
• 3.1.1 表达菌的复苏及诱导表达
• 3.1.2 重组蛋白的提取
• 3.1.3 重组蛋白的纯化
• 3.1.4 重组蛋白的复性
• 3.1.5 纯化蛋白的PAGE电泳鉴定和浓度的测定
• 3.2 ELISA试剂盒组装
• 3.2.1 外包装及标签的制备
• 3.2.2 试剂盒内组分
• 3.2.3 试剂盒内试剂的配制及质量控制
• 3.2.4 试剂盒内抗原包被板的制备
• 3.2.5 试剂盒的操作说明书
• 3.3 试剂盒的评价
• 3.3.1 试剂盒保存期试验
• 3.3.2 试剂盒特异性试验
• 3.3.3 试剂盒灵敏度试验
• 3.3.4 试剂盒重复性试验
• 3.3.5 试剂盒结果判定标准的确定
• 3.3.6 对比诊断试验
• 3.3.7 与国外同类试剂盒的对比试验
• 3.3.8 试剂盒的复核
• 3.4 试剂盒的初步应用
• 4 试验结果
• 4.1 GP51重组蛋白的制备及纯化结果
• 4.1.1 纯化蛋白的PAGE电泳鉴定结果
• 4.1.2 重组蛋白的浓度测定结果
• 4.2 试剂盒研制结果
• 4.2.1 方阵滴定结果
• 4.2.2 试剂盒的组成
• 4.2.3 ELISA试剂盒的组装结果
• 4.3 试剂盒的评价结果
• 4.3.1 试剂盒的保存期试验结果
• 4.3.2 试剂盒特异性试验结果
• 4.3.3 试剂盒灵敏度试验结果
• 4.3.4 试剂盒重复性试验结果
• 4.3.5 试剂盒阴性、阳性临界值确定结果
• 4.3.6 对比诊断试验结果
• 4.3.7 与国外同类试剂盒的对比试验结果
• 4.3.8 试剂盒的复核结果
• 4.4 试剂盒的初步应用结果
• 5 讨论
• 5.1 试剂盒的包被抗原
• 5.1.1 gp51的抗原性
• 5.1.2 gp51蛋白的纯化
• 5.2 试剂盒的保存期
• 5.2.1 包被抗原的保护剂
• 5.2.2 试剂盒封闭剂的选择
• 5.3 试剂盒操作的质量控制
• 5.3.1 血清样品的处理及保存
• 5.3.2 试剂盒操作的质量控制
• 5.3.3 试剂盒临界值的确定
• 5.4 试剂盒的适用对象
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢