钙调蛋白抑制剂W-7对NMDA诱导的神经元损伤及癫痫动物模型的神经保护机制

论文摘要

目的1观察钙调蛋白抑制剂N-（6-氨基己烷基）-5-氯-1萘-黄胺（W-7）对N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartate,NMDA）诱导的体外培养的乳鼠大脑皮质神经元损伤的保护作用及机制。2观察钙调蛋白抑制剂W-7对戊四唑（Pentylenetetrazol,PTZ）诱导的癫痫大鼠模型的保护作用及机制。方法第一部分取原代培养7天的乳鼠大脑皮质神经元随机分为5组:（1）正常对照组:仅用杜氏改良低糖型F12培养基（Dilbecco’s modified eagle medium/F12,DMEM/F12）完全培养基。（2）NMDA损伤组:去除正常神经元培养液,加入NMDA 50μmol/L,处理时间10min。（3）3个剂量的W-7保护组:分别为保护组-1:25μmol/L,保护组-2:50μmol/L,保护组-3:100μmol/L,先加入W-7,培养24h后加入NMDA 50μmol/L。MTT法检测细胞存活力;在荧光显微镜下观察皮质神经元的形态;丫啶橙染色检测凋亡细胞数量;检测培养上清液中乳酸脱氢酶（Lactic acid dehydrogenase,LDH）含量;用免疫细胞化学染色法及免疫印记法检测皮质神经元内核转录因子κB（Nuclear factorkappa B,NF-κB）p65、p38半胱氨酸基天冬氨酸（Cysteiyl aspartate specificproteinase,MAPK）蛋白的表达。第二部分健康SD大鼠38只,随机分为5组,对照组（腹腔注射生理盐水）、PTZ组（腹腔注射PTZ）和三个剂量的W-7组（腹腔注射PTZ和W-7）。观察行为学表现;脑组织中LDH含量测定;HE染色观察神经元的形态学改变;免疫组织化学方法和免疫印记方法检测海马组织NF-κBp65、p38MAPK和半胱氨酸基天冬氨酸（Cysteiyl aspartate specific proteinase,caspase）-3蛋白表达的变化。结果第一部分（1）同对照组比较,NMDA损伤组神经元凋亡增加（P＜0.01）,W-7组减少,呈剂量依赖性（P＜0.05）。（2）NMDA组培养上清液中LDH含量高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.01）;W-7干预组LDH含量低于NMDA组,差异均有显著性意义（P＜0.05）;（3）NMDA组NF-κB、p38MAPK蛋白表达增加（P＜0.01）,W-7干预组表达减少,呈剂量依赖性（P＜0.05,P＜0.01）。第二部分PTZ诱导的癫痫大鼠发作程度为Ⅳ-Ⅴ级,W-7保护组发作程度明显减轻,表现为Ⅰ-Ⅲ级发作（P＜0.05）。PTZ组脑组织LDH含量较对照组明显升高,差异有统计学意义（P＜0.01）,W-7保护组同PTZ组比较,LDH含量明显下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,免疫组织化学染色和免疫印记实验显示,PTZ组caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达明显增强（P＜0.01）,三个剂量的W-7组表达明显减弱,其差异均具有显著性意义（P＜0.05,P＜0.01）。结论1 NMDA导致体外培养的乳鼠大脑皮质神经元NF-κBp65、p38MAPK蛋白表达增高,促进神经元凋亡。2不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7可减轻NMDA诱导的皮质神经元的损伤,具有保护作用,其作用机制是通过抑制NF-κBp65、p38MAPK的蛋白表达实现的。3 PTZ导致癫痫大鼠模型脑组织中caspase-3、NF-κBp65和p38MAPK蛋白表达增高,提示PTZ癫痫模型可导致以凋亡为主的神经元损伤。4不同浓度的钙调蛋白抑制剂W-7对PTZ诱导的癫痫大鼠具有保护作用,其作用机制是通过抑制caspase-3,NF-κBp65和p38MAPK的蛋白表达实现的,可干预癫痫的发生和发展过程。

论文目录

• 英文缩略词
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 钙调蛋白抑制剂W-7对NMDA诱导的神经元损伤的神经保护机制
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 钙调蛋白抑制剂W-7对PTZ诱导的癫痫大鼠的神经保护机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 小结
• 附图
• 文献综述
• 攻读学位期间发表文章和获奖情况
• 个人简历
• 致谢