纳豆激酶和hGM-CSF在家蚕杆状病毒表达系统中表达纯化及活性研究

论文题目: 纳豆激酶和hGM-CSF在家蚕杆状病毒表达系统中表达纯化及活性研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 朱立成

导师: 张耀洲,金勇丰

关键词: 纳豆激酶,溶纤活性,亲和纯化,家蚕杆状病毒表达系统

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 纳豆激酶（nattokinase，NK）是由纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）或纳豆枯草杆菌（Bacillus subtilis natto）分泌的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶。体内外实验证明该酶能显著溶解体内外血栓，明显缩短纤维蛋白的溶解时间。并具有激活静脉内皮细胞产生组织型纤溶酶原激活剂（t-PA），降解和失活纤溶酶原激活剂的抑制剂（pAI-1）和催化尿激酶原转变成尿激酶等功能。动物实验和人体志愿者实验表明，纳豆激酶经口服后可迅速入血，纤溶活性强，作用时间长，具有安全性好、口服有效等优点。 本研究第一部分内容是克隆了纳豆激酶基因。用PCR的方法从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中，克隆了包括编码信号肽、前导肽和成熟肽序列的纳豆激酶基因。基因测序结果表明，本研究克隆的纳豆激酶基因和Nakamura报道的Bacillus subtilis var．natto subtilisin NAT（aprN） gene（genbank 登录号：S51909）序列完全一致。 本研究第二部分内容是在大肠杆菌中表达了纳豆激酶基因并制备了抗纳豆激酶多克隆抗体。把纳豆激酶基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28a+的BamHI和XhoI位点上，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了纳豆激酶基因。SDS-PAGE分析表明，在大肠杆菌中表达的纳豆激酶融合蛋白分子量约为31kD。表达产物通过HiTrapTM Chelating HP亲和层析柱纯化。纯化产物与弗氏佐剂混合研磨制备了乳化疫苗，皮下多点免疫新西兰大白兔，制备了抗纳豆激酶抗体血清。抗体血清用Protein A亲和凝胶柱纯化。用琼脂板双向扩散实验初步检测了抗体滴度。ELISA间接法测得抗体滴度大约为1：16000，Western blotting检测含重组质粒的大肠杆菌总蛋白和纯化的纳豆激酶融合蛋白都有一条特异的条带。 本研究第三部分内容是在家蚕杆状病毒表达载体系统中表达了纳豆激酶基因。把纳豆激酶基因克隆到家蚕杆状病毒表达载体系统转移载体pBacPAK8的EcoRI和BamHI酶切位点之间，获得重组转移载体pBacPAKNK。将重组转移载体DNA和线性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共转染BmN细胞，通过3轮空斑筛选获得纯化的重组病毒Bm-BacPAKNK。Bm-BacPAKNK感染BmN

论文目录:

致谢

缩略语

摘要

ABSTRACT

第一章 昆虫杆状病毒表达系统研究进展

一、杆状病毒生活史

二、昆虫杆状病毒表达系统研究进展

1.昆虫杆状病毒表达系统的基本原理

2.杆状病毒表达系统转移载体

3.重组病毒筛选方法的改进

4.不同昆虫杆状病毒表达系统特点分析

参考文献

第二章 纳豆激酶研究进展

1.纳豆

2.纳豆激酶的生化特性

3.纳豆激酶的基因结构

4.纳豆激酶的蛋白质结构

5.纳豆激酶的生物学功能

6.纳豆激酶的溶栓作用研究

7.纳豆激酶的溶栓机制

8.纳豆激酶基因工程

参考文献

第三章 纳豆激酶基因克隆、在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备

1.材料与方法

1.1 菌株及载体

1.2 酶和化学试剂

1.3 细菌基因组DNA提取、质粒DNA提取、低熔点胶回收、连接反应等

1.4 PCR扩增

1.5 重组表达载体的构建

1.6 纳豆激酶在大肠杆菌中表达

1.7 大肠杆菌中表达的纳豆激酶纯化

1.8 蛋白质浓度测定

1.9 兔抗纳豆激酶的多克隆抗体的制备与鉴定

1.10 表达产物溶纤活性分析

2.结果与分析

2.1 PCR扩增纳豆激酶基因

2.2 pETNK重组质粒鉴定

2.3 纳豆激酶基因序列测定

2.4 纳豆激酶的表达

2.5 大肠杆菌表达的纳豆激酶纯化

2.6 抗纳豆激酶多克隆抗体的制备与鉴定

2.7 表达产物的溶纤活性分析

3.讨论

参考文献

第四章 重组病毒的构建及在家蚕细胞中表达纳豆激酶

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果

2.1 纳豆激酶基因的克隆及杆状病毒转移载体的构建

2.2 Bm-BacPAK6病毒基因组DNA的提取与线性化

2.3 共转染和重组病毒筛选

2.4 重组病毒滴度测定

2.5 重组病毒的Southern blotting杂交鉴定

2.6 SDS-PAGE电泳和Western blotting

2.7 表达产物体外纤溶活性检测

3.讨论

参考文献

第五章 纳豆激酶在家蚕幼虫中表达及纯化

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果与分析

2.1 在家蚕幼虫中表达纳豆激酶

2.2 家蚕幼虫中表达产物SDS—PAGE和Western blotting结果

2.3 家蚕幼虫中表达产物纯化

2.4 家蚕幼虫中表达产物体外溶纤活性分析

3.讨论

参考文献

第六章 家蚕杆状病毒表达系统表达的纳豆激酶口服溶纤效果

1.材料和方法

1.1 材料

1.2 大鼠实验分组

1.3 纳豆激酶粗酶制备

1.4 观察指标及血液标本处理

1.5 t-PA和PAI-1活性测定

1.6 统计学分析

2.结果与分析

2.1 灌胃蚕表达纳豆激酶对大鼠血液中组t-PA浓度的影响

2.2 灌胃蚕表达纳豆激酶对大鼠血液中组PAI-1浓度的影响

3.讨论

参考文献

第七章 6xHIS-HGM-CSF在家蚕幼虫中表达纯化的研究

1.材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2.结果与分析

2.1 pBacPAKHis-GM-CSF杆状病毒转移载体的构建

2.2 重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定

2.3 rhGM-CSF在家蚕体内表达及其生物活性的检测

2.4 蚕血淋巴中rhGM-CSF的纯化、Western Blotting分析

3.讨论

参考文献：

主要结论

攻读博士学位期间已发表的论文目录

发布时间: 2006-09-06

参考文献

• [1].纳豆激酶结构与功能的研究[D]. 郑忠亮.武汉大学2005
• [2].纳豆激酶液体发酵的条件优化及其调控的研究[D]. 谢秋玲.华南理工大学1999
• [3].纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达[D]. 黄志立.华南理工大学2001
• [4].优化设计并人工合成的纳豆激酶基因在甜瓜和番茄中的高效表达[D]. 韩岚.内蒙古大学2015
• [5].纳豆激酶结构与功能关系的研究[D]. 翁美芝.武汉大学2011
• [6].纳豆激酶的体外定向进化[D]. 蔡永君.武汉大学2011
• [7].纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达[D]. 刘朔.南京农业大学2007
• [8].枯草芽孢杆菌Na-002纳豆激酶基因的克隆、表达及定点突变研究[D]. 周波.山东农业大学2011

相关论文

• [1].纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达[D]. 刘朔.南京农业大学2007
• [2].基于家蚕杆状病毒表达系统表达外源基因研究[D]. 岳万福.浙江大学2009
• [3].家蚕新型高效杆状病毒表达系统的开发和应用研究[D]. 曹翠平.浙江大学2007
• [4].纳豆激酶结构与功能的研究[D]. 郑忠亮.武汉大学2005
• [5].家蚕表达霍乱毒素B亚基与人胰岛素或胰岛素B链融合蛋白及其抗自身免疫性糖尿病的研究[D]. 龚朝辉.浙江大学2006
• [6].家蚕生物反应器表达人GM-CSF的研究[D]. 陈健.浙江大学2005
• [7].家蚕生物反应器表达人乳铁蛋白及其功能研究[D]. 刘涛.浙江大学2005
• [8].纳豆激酶液体发酵的条件优化及其调控的研究[D]. 谢秋玲.华南理工大学1999
• [9].新型纤溶酶得产生菌选育、发酵优化及酶学性质研究[D]. 范晓丹.华南理工大学2006
• [10].纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达[D]. 黄志立.华南理工大学2001

标签：纳豆激酶论文;  溶纤活性论文;  亲和纯化论文;  家蚕杆状病毒表达系统论文;