酿酒酵母TOR/Sch9对Ras-cAMP信号通路的调控研究

论文摘要

葡萄糖可以诱导解除葡萄糖抑制的酿酒酵母细胞的cAMP水平迅速而短暂升高,并激活PKA,导致细胞由低PKA表型转向高PKA表型,同时细胞进入发酵生长。氮源、磷酸盐也可以诱导解除氮源、磷酸盐抑制的酿酒酵母细胞的生长,并使PKA调控的稳定期特征迅速消失,细胞迅速由低PKA表型向高PKA表型转变。氮源或磷酸盐激活PKA下游靶标需要葡萄糖的存在。同样,葡萄糖激活PKA下游靶标也需要氮源或磷酸盐的存在。必然存在某个信号转导网络收集来自各种不同营养感知系统的信息并将其整合为一个通用的细胞响应作用于PKA的下游靶标。本研究将探讨氮源通过何种机制调节葡萄糖诱导的cAMP信号。本研究发现氮源缺乏条件下葡萄糖诱导的cAMP信号消失,雷帕霉素处理后葡萄糖诱导的cAMP信号也消失,而表达具有雷帕霉素抗性的TOR1-RR等位基因可以消除雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP信号的影响。TOR为氮源和雷帕霉素的靶标,雷帕霉素处理使细胞表现出类似氮源缺乏条件下的表型。这说明氮源通过TOR调节葡萄糖诱导的cAMP信号。Sch9是TORC1的主要下游靶标。缺失SCH9后葡萄糖诱导的cAMP信号消失,这说明氮源通过TOR-Sch9调节Ras-cAMP信号通路。本研究揭示了TOR-Sch9调控Ras-cAMP信号通路的机制。TOR和Sch9对PKA有抑制作用,雷帕霉素处理或缺失SCH疤? PKA水平增高,较高PKA条件下Cdc25被PKA的催化亚基超磷酸化,被超磷酸化的Cdc25将从细胞膜上游离而分布于细胞质中,进而拉开了与效应物Ras-Cyr1的距离,并实现对Ras-cAMP信号通路的反馈邑?饔?从而使葡萄糖诱导的cAMP信号消失。本研究发现Sch9通过调节PKA的调节亚基和催化亚基的细胞定位实现对PKA的调节。缺失SCH9后PKA的调节亚基Bcy1向细胞核转移,而催化亚基Tpk1、Tpk2和Tpk3向细胞质转移,这样更多的催化亚基从调节亚基的抑制中解除出来成为有活性的催化亚基,PKA活性增高。本研究还表明Sch9对Bcy1的磷酸化有调节作用,sch9Δ突变株中Bcy1的磷酸化明显减弱。本研究表明Bcy1的细胞定位与碳源,氮源以及PKA水平有关。以葡萄糖为碳源时的对数期细胞中Bcy1主要定位在细胞核中,而稳定期的细胞中或以非发酵碳源为碳源时Bcy1定位在细胞质中的量增多。氮源通过Sch9调节Bcy1的定位。氮源缺乏条件下或缺失SCH9后Bcy1集中在细胞核中。Sch9通过Zds1调节Bcy1的定位,且Sch9对Zds1的磷酸化有调节作用。Bcy1的定位还受Yak1、Rim15、Msn2和Msn4的调节。yak1Δ突变株、rim15Δ突变株和msn2Δmsn4Δ突变株中Bcy1主要定位在细胞核中。PKA水平较高时,Bcy1主要定位在细胞核中,PKA水平较低时,Bcy1定位在细胞质中的量增多。本研究还发现Sch9对Yak1的定位有调节作用。在以葡萄糖为碳源的对数期野生型细胞中Yak1主要定位在细胞质中,缺失SCH9后Yak1向细胞核转移。定位在细胞核中的Yak1对细胞周期有抑制作用,这可能是sch9Δ突变株PKA水平较高但却表现出低PKA表型的原因之一。本研究还表明,缺失RIM15和GIS1对葡萄糖诱导的cAMP信号没有影响。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 Ras-cAMP 信号通路及其主要作用元件
• 1.1.1 Ras-cAMP 信号通路的主要作用元件
• 1.1.2 Ras /cAMP/PKA 的下游靶标
• 1.2 FGM 信号通路及其主要作用元件
• 1.3 Sch9 和PKA 的相互作用关系
• 1.4 TOR 信号通路
• 1.4.1 TOR 的上游调控元件
• 1.4.2 TOR 的下游元件
• 1.4.3 TOR 信号通路与酿酒酵母时序寿命的关系
• 1.5 TOR 信号通路和Ras/PKA 信号通路的相互作用关系
• 1.6 TOR 信号通路和FGM 信号通路的相互作用关系
• 1.7 本论文的研究思路
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒、菌株与引物
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法（CTAB 法）
• 2.2.3 酵母染色体的快速分离
• 2.2.4 PCR 扩增反应
• 2.2.5 DNA 的限制酶消化
• 2.2.6 DNA 的连接反应
• 2.2.7 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.8 从琼脂糖中回收DNA
• 2.2.9 酵母细胞的转化方法
• 2.2.10 质粒缺口修复
• 2.2.11 酵母中质粒的回收
• 2.2.12 酵母交配型的验证
• 2.2.13 不同交配型酵母细胞之间的杂交
• 2.2.14 产孢及四分体孢子拆分
• 2.2.15 Dilution 实验方法
• 2.2.16 水浴热击实验方法
• 2.2.17 cAMP 定量测量
• 2.2.18 蛋白质浓度的定量（Bio-Rad 方法）
• 2.2.19 玻璃珠法提取酿酒酵母总蛋白
• 2.2.20 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 2.2.21 Western blot 蛋白免疫实验
• 第三章 氮源通过TOR 调控Ras-cAMP 信号通路
• 3.1 本章所用质粒的构建
• 3.2 葡萄糖诱导的cAMP 信号需要氮源的存在
• 3.3 雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP 信号的影响
• 3.4 表达TOR1-RR 等位基因可消除雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP 信号的影响
• 3.5 氮源缺乏条件和雷帕霉素对Cdc25 磷酸化的影响
• 3.6 本章小结
• 第四章Sch9 对葡萄糖诱导的cAMP 信号的调控
• 4.1 本章所用菌种及质粒的构建
• 4.1.1 SCH9 基因的缺失
• 4.1.2 质粒YCplac22-SCH92D3E 的构建
• 4.2 缺失SCH9 对葡萄糖诱导的cAMP 信号的影响
• 4.3 表达SCH92D3E 等位基因可减小雷帕霉素对葡萄糖诱导的cAMP 信号的影响
• 4.4 缺失SCH9 使PKA 活性增强
• 4.5 Sch9 通过PKA 的催化亚基调节Cdc25 的磷酸化
• 4.6 本章小结
• 第五章 Rim15 和 Gis1 对葡萄糖诱导的 cAMP 信号的影响
• 5.1 本章所需菌株的构建
• 5.1.1 rim15Δ的构建
• 5.1.2 gis1Δ的构建
• 5.2 Rim15 对葡萄糖诱导的cAMP 信号的影响
• 5.3 Gis1 对葡萄糖诱导的cAMP 信号的影响
• 5.4 本章小结
• 第六章Sch9 对PKA 调节亚基Bcy1 的调控作用
• 6.1 菌种及质粒的构建
• 6.1.1 MSN2 基因的缺失
• 6.1.2 MSN4 基因的缺失
• 6.1.3 ZDS1 基因的缺失
• 6.1.4 质粒YCplac22- BCY1-3xHA 的构建
• 6.1.5 质粒YCplac22-GFP-BCY1 的构建
• 6.1.6 质粒YCplac181-YAK1 的构建
• 6.1.7 质粒YCplac22-SCH9-13xMYC 和YEplac181-SCH9 的构建
• 6.1.8 质粒 YEplac195-ZDS1 的构建
• 6.2 Sch9 调节Bcy1 的定位及磷酸化
• 6.3 氮源缺乏条件下Bcy1 的定位
• 6.4 雷帕霉素对Bcy1 定位的影响
• 6.5 Zds1 调节Bcy1 的定位
• 6.6 Yak1 调节Bcy1 的定位及磷酸化
• 6.7 Msn2、Msn4 和 Rim15 调节 Bcy1 定位
• 6.8 Bcy1 的定位与PKA 水平相关
• 6.9 本章小结
• 第七章 Sch9 对PKA 催化亚基的调控作用
• 7.1 质粒的构建
• 7.1.1 质粒YCplac22-TPK1-GFP 的构建
• 7.1.2 质粒YCplac22-TPK1-3xHA 的构建
• 7.1.3 质粒YCplac33-tpk1wl-GFP的构建
• 7.1.4 质粒YCplac22-TPK2-GFP 的构建
• 7.1.5 质粒YEplac112-TPK3-GFP 的构建
• 7.2 Sch9 调节Tpk1 的定位
• 7.3 氮源对Tpk1 定位的影响
• 7.4 雷帕霉素对Tpk1 定位的影响
• 7.5 Tpk1 的细胞核定位不依赖于Bcy1
• 7.6 Sch9 调节Tpk2 的定位
• 7.7 Sch9 调节Tpk3 的定位
• 7.8 本章小结
• 第八章总结与展望
• 8.1 主要工作总结
• 8.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 附录1 生化名词缩写
• 附录2 基因及其相应编码产物
• 致谢