玉米螟生防工程菌株构建的研究

论文摘要

玉米螟是世界性重大农业害虫之一,危害严重且分布极广。因其繁殖快、世代多以及较强的农药抗性,对其进行化学防治将面临越来越大的困难。因此,寻找高效、安全、环保的农药替代物已成为亟待解决问题。在本研究中,以玉米和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis作为研究对象,在明确茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate,MJA）诱导玉米抗性反应影响亚洲玉米螟生长发育基础上通过双向电泳和MS技术鉴定了60个响应MJA处理的差异表达蛋白,并对其进行了功能分析。对4个重要植物防御相关蛋白编码基因构建了原核表达载体并成功诱导了重组蛋白,利用生物测定的方法验证了重组蛋白对亚洲玉米螟生物学活性的影响。其中,pET28a-TRX和pET28a-PRP表达的重组蛋白对亚洲玉米螟幼虫的生长发育产生了显著影响,生长抑制率分别达30.33%和34.14%。pET28a-GRBP表达的融合蛋白亦对蛹重有显著影响,这暗示我们所获得的玉米防御蛋白可能是一种良好的植物抗虫蛋白。谷胱甘肽-S-转移酶是昆虫体内一类重要解毒酶系,它对许多有毒化合物具有代谢消化作用,从而增强昆虫的抗性。采用RT-PCR和RACE技术从亚洲玉米螟中肠中克隆了一个谷胱甘肽-S-转移酶基因,将其命名为OfGST,并进行了生物信息学分析。以此为基础,构建了原核表达载体并进行融合蛋白诱导表达,以纯化的重组蛋白制备了多克隆抗体。Western blot分析显示该解毒酶经丁布诱导后表达量增加,至24h时最大。同时,利用表达载体L4440构建了RNAi重组质粒并将其导入受体菌HT115中,经IPTG诱导获得了表达目的dsRNA的RNAi工程菌。自然饲喂取食法进行干扰效果检测表明,与对照组相比,干扰组亚洲玉米螟幼虫死亡率高达54%,初步证明我们成功构建了亚洲玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因的RNAi工程菌,这为农业上对亚洲玉米螟进行生物防治提供了一条新途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 绪论
• 1.1 玉米螟危害及防治概述
• 1.2 植物的诱导防御
• 1.2.1 防御相关基因的诱导表达
• 1.2.2 诱导植物次生代谢产物含量增加
• 1.2.3 诱导防御蛋白的积累
• 1.2.4 相关信号途径的诱导激活
• 1.3 植物与昆虫互作研究概述
• 1.3.1 植物与昆虫互作基因水平研究概述
• 1.3.2 植物与昆虫互作蛋白质组学水平研究进展
• 1.4 昆虫解毒酶系研究概述
• 1.5 害虫生防工程菌株研究应用概述
• 1.6 本研究目的与意义
• 第2章 外源MJA处理对玉米叶片丁布含量及亚洲玉米螟生长发育的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 主要试剂及仪器
• 2.1.3 玉米幼苗培养及外源MJA处理
• 2.1.5 外源MJA处理后玉米叶片中丁布含量的测定
• 2.1.6 MJA诱导玉米后对亚洲玉米螟生长发育和繁殖影响的测定
• 2.1.7 MJA诱导玉米后对亚洲玉米螟幼虫体重及蛹重的影响
• 2.1.8 外源MJA诱导处理后亚洲玉米螟生命表构建
• 2.1.9 数据统计与分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 丁布标准样品的提取及检测
• 2.2.2 不同品种玉米经外源MJA处理后丁布含量的测定
• 2.2.3 MJA诱导处理后亚洲玉米螟的生物活性测定
• 2.2.4 MJA诱导处理对亚洲玉米螟幼虫发育历期的影响
• 2.2.5 MJA诱导处理对亚洲玉米螟成虫寿命及产卵量的影响
• 2.2.6 MJA诱导对亚洲玉米螟幼虫体重及蛹重的影响
• 2.2.7 225μmol/L MJA处理对亚洲玉米螟次代种群生命表参数影响
• 2.3 本章小结
• 第3章 玉米叶片响应MJA处理后蛋白质组学分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料及处理
• 3.1.2 主要试剂及仪器
• 3.1.3 实验所需常用溶液及试剂的配制
• 3.1.4 玉米叶片总蛋白提取及定量
• 3.1.5 蛋白样品双向电泳及软件分析
• 3.1.6 差异表达蛋白点的质谱鉴定及数据处理
• 3.1.7 防御蛋白编码基因克隆
• 3.1.8 荧光定量PCR（Quantitativ6-Real Time PCR）
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 玉米叶片蛋白提取、定量和SDS-PAGE蛋白谱分析
• 3.2.2 不同处理条件下玉米叶片蛋白双向电泳分析
• 3.2.3 差异蛋白点nano ESI MS/MS鉴定
• 3.2.4 差异表达蛋白的功能分析
• 3.2.5 几个重要植物防御相关蛋白基因的克隆与序列测定
• 3.2.6 编码防御相关蛋白基因的qRT-PCR分析
• 3.3 本章小结
• 第4章 玉米防御蛋白基因原核表达载体构建及亚洲玉米螟生物学活性测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试植物与昆虫
• 4.1.2 主要试剂及仪器
• 4.1.3 玉米防御蛋白编码基因原核表达载体构建
• 4.1.4 融合蛋白诱导表达
• 4.1.5 亚洲玉米螟生物学活性测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 防御蛋白编码基因原核表达载体构建及酶切验证
• 4.2.2 融合蛋白诱导表达及SDS-PAGE验证
• 4.2.3 融合蛋白对亚洲玉米螟生长发育的影响
• 4.3 本章小结
• 第5章 亚洲玉米螟GST RNAi生防工程菌株构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试昆虫
• 5.1.2 主要试剂及仪器
• 5.1.3 主要使用试剂的配制方法
• 5.1.4 亚洲玉米螟OfGST基因的克隆与生物信息学分析
• 5.1.5 亚洲玉米螟OfGST基因原核表达载体构建
• 5.1.6 多克隆抗体制备与检测
• 5.1.7 Western blot检测
• 5.1.8 亚洲玉米螟OfGST RNAi工程菌株的构建
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 亚洲玉米螟幼虫中肠总RNA的提取、鉴定及cDNA合成
• 5.2.2 亚洲玉米螟谷胱甘肽-S-转移酶基因（OfGST）全长序列获得
• 5.2.3 亚洲玉米螟OfGST基因生物信息学分析
• 5.2.4 pET28a-OfGST重组表达载体的构建
• 5.2.5 pET28a-OfGST的原核诱导表达及蛋白纯化
• 5.2.6 多克隆抗体的制备与ELASA检测
• 5.2.7 Western Blot分析
• 5.2.8 构建表达dsRNA的重组载体L4440-OfGST
• 5.2.9 饲喂法RNAi效果检测
• 5.3 本章小结
• 第六章 讨论
• 6.1 MJA诱导玉米抗性对丁布含量及亚洲玉米螟生长发育的影响
• 6.2 玉米叶片响应MJA处理的蛋白质组学分析
• 6.3 防御蛋白基因原核表达载体构建及亚洲玉米螟生物学活性测定
• 6.4 亚洲玉米螟OfGST基因克隆及其生防工程菌株的构建
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文