朊蛋白基因表达与传染性海绵状脑病发生发展关系的研究

论文题目: 朊蛋白基因表达与传染性海绵状脑病发生发展关系的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 基础兽医学

作者: 宁章勇

导师: 赵德明

关键词: 动物传染性海绵状脑病,阮蛋白,基因表达

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 传染性海绵状脑病是一组人类和动物的神经退行性疾病,人们认为该病是由机体正常编码的朊蛋白基因表达的细胞型朊蛋白（PrPC）转变为蛋白酶抗性的致病性朊蛋白(PrPSC)而导致。在疾病发生、发展过程中,PrPSC作为模板诱导基础分子PrPC发生构象的改变,导致PrPC形成PrPSC并在中枢神经系统聚集,引发动物的传染性海绵状脑病。因此,研究作为基础分子的细胞型朊蛋白的表达及其在TSE病理发生中的作用是研究动物传染性海绵状脑病的关键点,对探索动物传染性海绵状脑病的发生、发展具有重要的意义。目前,动物传染性海绵状脑病的研究主要依赖于实验动物和培养神经细胞两种模型。本研究针对这两种模型,从朊蛋白基因表达及其参与TSE发生、发展的角度,对野生型金黄地鼠中枢神经和外周组织朊蛋白基因的表达模式、发育相关的动态表达、处理重组朊蛋白脑内接种的影响和细胞型朊蛋白在培养SD大鼠神经源性细胞作用模型病理发生中的作用等方面进行了剖析,为探索动物传染性海绵状脑病发生的分子机理和朊蛋白与疾病发生、发展的关系提供了基础数据,研究内容如下: 1 为探索实验动物朊蛋白基因的表达模式和发育相关的动态表达,对不同年龄段的野生型金黄地鼠进行了中枢神经系统和外周器官朊蛋白基因表达的定量。结果显示:同一年龄点,朊蛋白基因在脑内各部位和淋巴系统内的表达量显著高于外周器官;随着年龄的变化,朊蛋白基因的表达呈现特定的时间相关性变化。朊蛋白基因表达的组织特异性和时间相关的动态变化将揭示朊蛋白与疾病发生的关系。 2 对重组牛朊蛋白进行了化学处理后脑内接种金黄地鼠,200天后对朊蛋白抗性进行了western-blotting检测,对脑组织朊蛋白基因的表达进行了分析。结果发现实验组和对照组朊蛋白基因表达无显著差异;对实验组和对照组脑部3个部位的westem-Blot检测发现蛋白量也无显著差异;采用蛋白酶消化后,无抗性蛋白出现。 3 利用物理和酶消化相结合的分离方法,结合药物选择和差速粘附等纯化手段,成功地对野生型SD大鼠大脑皮质神经元、大脑皮质星形胶质细胞和小脑颗粒神经元进行了体外的分离、培养和鉴定。为研究动物传染性海绵状脑病致病机理细胞模型的建立提供了良好的实验材料。 4 为研究动物传染性海绵状脑病中神经元退行性病变和胶质细胞增生的机理,按照体外模拟的原则,利用人工合成的PrPSC类似物构建野生型SD大鼠神经源性细胞模型,对神经元和胶质细胞的存活率及基因相对表达进行了研究。结果发现,朊蛋白多肽在50μM浓度下,在间期作用时,可以引起大脑皮质神经元和小脑颗粒神经元的显著死亡,而胶质细胞增生明显。在此作用模型下,神经细胞的朊蛋白基因表达在特定的时间出现显著的下降,而星形胶质细胞朊蛋白的基因表达显著上升。结果提示,朊蛋白通过调节其基因的表达水平而对神经元产生毒性作用。

论文目录:

第一章 文献综述

第一节 朊蛋白基因表达与动物传染性海绵状脑病的发生

1 传染性动物海绵状脑病及朊病毒学说

2 传染性海绵状脑病的致病机制

3 朊蛋白基因表达与动物传染性海绵状脑病的发生

4 展望

第二节 朊蛋白生物学与朊蛋白基因表达异常的生理效应

1 朊蛋白生物合成和转运

2 朊蛋白基因表达异常的生理效应

3 朊蛋白的翻译后修饰

4 朊蛋白的受体

5 展望

第三节 传染性海绵状脑病研究的实验模型

1 动物传染性海绵状脑病研究的动物模型

2 动物传染性海绵状脑病研究中的细胞模型

3 展望

第四节 实时荧光定量PCR技术及应用

1 基本原理

2 实时荧光定量PCR中几个重要的术语

3 定量方法

4 实时荧光定量PCR技术的应用

5 存在的问题及应用前景

前言

第二章：朊蛋白基因在金黄地鼠脑和外周组织的表达

前言

第一节 材料与方法

1 材料

2 方法

2.1 利用TRIZOL试剂盒提取总RNA

2.2 总RNA的纯化

2.3 cDNA的合成

2.4 PCR产物的回收

2.5 pGEM~(?)-T Easy载体的连接反应

2.6 感受态细胞的制备、效价的测定及质粒DNA的转化

2.7 重组质粒快速鉴定的Cracking法

2.8 质粒DNA的少量制备

2.9 测序反应

2.10 荧光定量分析

3 统计学分析

第二节 朊蛋白基因表达标准品质粒和标准曲线的构建

1 结果与分析

1.1 组织RNA提取和目的基因片断的扩增

1.2 标准模板的鉴定

1.3 标准模板的定量

1.4 标准曲线的构建

2 讨论

第三节 金黄地鼠脑组织及外周器官朊蛋白基因表达的定量

1 动物及取材

2 样品基因表达的定量

2.1 实时荧光定量PCR检测的动力学

2.2 不同年龄各个组织mRNA表达的定量

2.3 朊蛋白基因在正常金黄地鼠中枢和外周的表达模式

3 讨论

3.1 关于实时荧光定量PCR绝对定量

3.2 关于金黄地鼠年龄的选择

3.3 关于朊蛋白基因在中枢神经系统、淋巴系统和外周组织的表达

第三章 处理重组朊蛋白接种金黄地鼠对朊蛋白基因表达的影响

前言

1 材料

2 方法

2.1 重组朊蛋白的制备和处理

2.2 朊蛋白基因表达的定量

2.3 Western blotting分析

3 结果

3.1 接种金黄地鼠的临床观察

3.2 接种后朊蛋白基因每ng总RNA中朊蛋白基因mRNA的拷贝数

3.3 Western blotting检测

3.4 蛋白酶抗性蛋白的检测

4 讨论：

第四章 大脑皮质神经元、星形胶质细胞和小脑颗粒神经元的体外培养和鉴定

前言

1 材料

2 方法

2.1 神经元的体外分离和培养

2.2 大脑皮质星形胶质细胞的体外分离和培养

2.3 培养细胞的鉴定

2.4 培养细胞的生长观测及活细胞计数

3 结果

3.1 大脑皮质神经元的培养与鉴定

3.2 小脑颗粒神经元的培养与鉴定

3.3 大脑皮质星形胶质细胞培养与鉴定

3.4 培养细胞生长密度、胞体短直径和活细胞计数

4 讨论

4.1 关于培养细胞的取材

4.2 培养神经元和星形胶质细胞的纯化

4.3 神经元和星形胶质细胞培养时的消化时间和接种密度

4.4 培养神经元和星形胶质细胞的鉴定

第五章 PrP106-126对培养神经细胞和星形胶质细胞朊蛋白基因表达的影响

前言

1 材料

2 方法

2.1 神经细胞和星星胶质细胞的实验分组

2.2 MTT比色法细胞存活分析

2.3 分子生物学方法

2.4 荧光定量分析

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 相对定量标准曲线的制备

3.2 培养细胞存活率的测定

3.3 朊蛋白基因表达的相对定量

4 讨论

4.1 关于相对定量

4.2 朊蛋白基因表达在该神经源性细胞模型中的作用

结论

创新

参考文献

附录

个人简历

致谢

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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• [3].抗—牛朊蛋白单链抗体检测系统的构建、表征与应用[D]. 张吉斌.华中农业大学2006
• [4].偶蹄动物朊蛋白基因结构特征及其重组蛋白抗原性的研究[D]. 吴润.甘肃农业大学2004
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• [7].N-端23-30位氨基酸对朊蛋白胞吞、抗氧化功能及繁殖影响的研究[D]. 宫彬彬.吉林大学2011
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