具有SOD和GPX活性的小肽设计及表达研究

论文摘要

机体中氧化-抗氧化平衡是机体内部重要的生理平衡之一。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和超氧化物歧化酶（SOD）都属于抗氧化酶系统,它们相互协调作用,缺一不可。GPX 是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶,它可以消除体内的过氧化氢及脂质过氧化物,具有很大的潜在药用价值。但是天然GPX 来源有限,稳定性差,不利于大规模制备及应用。SOD 是一类金属酶,广泛分布于需氧和耐氧的生物体各组织内,按金属辅基成分的不同可以分为CuZn-SOD, Mn-SOD 和Fe-SOD.这三类SOD 都催化超氧化物自由基O2-发生歧化反应。从二十世纪八十年代起,我室分别成功地获得了具有GPX 和SOD 活性的十五肽和十七肽酶模拟物。以此为基础,我们将17 肽SOD 模拟酶的氨基端与15 肽GPX模拟酶的羧基端连接在一起,以期待获得一个同时具有SOD 和GPX 活性的双功能酶。我们将该小肽的基因连接到pGEX-2T 质粒载体中,利用pGEX-2T 融合表达系统,在E.coli BL-21 诱导进行融合表达。然后经过一系列分离纯化手段得到了目的小肽。为后期分别硒化和引入铜（Ⅱ）后,测定其GPX 和SOD 活性的研究工作开辟了道路。

论文目录

• 第一章 前言
• 1. 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）及其模拟物
• 1.1 谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）
• 1.1.1 GPX 的结构
• 1.1.2 GPX 的催化机制
• 1.1.3 GPX 的生物学效应
• 1.2 GPX 的人工模拟
• 1.2.1 Ebselen 及其衍生物
• 1.2.2 硒代谷胱甘肽（GSeH）
• 1.2.3 硒化环糊精
• 1.2.4 硒化枯草杆菌蛋白酶
• 1.2.5 含硒抗体酶
• 2. 超氧化物歧化酶（SOD）
• 2.1 SOD 的结构
• 2.1.1 CuZn-SOD 的结构
• 2.1.2 Mn-SOD 和 Fe-SOD 的结构
• 2.2 SOD 的结构稳定性
• 2.3 SOD 的催化机理
• 2.3.1 金属辅基的作用
• 2.3.2 催化过程中“咪唑桥”的变化
• 2.3.3 SOD 的反应速度常数
• 3.G PX 和 SOD 的小肽模拟物
• 3.1 GPX 的十五肽模拟物
• 3.2 SOD 的十七肽模拟物
• 4. 实验设计方案
• 第二章 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 主要试剂
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 主要仪器
• 2. 方法
• 2.1 PCR 扩增小肽基因
• 2.2 回收DNA 及质粒的酶切、连接
• 2.3 连接产物转化至TG1
• 2.4 重组子的鉴定
• 2.5 小肽的表达
• 2.5.1 小肽基因连入表达载体
• 2.5.2 转化E. coli BL-21 菌株
• 2.5.3 目的蛋白质的表达
• 2.5.4 目的蛋白的纯化
• 2.5.5 目的蛋白的活性测定
• 第三章 结果与讨论
• 1. 结果
• 1.1 小肽双功能酶的设计
• 1.2 小肽双功能酶基因的合成
• 1.3 小肽双功能酶基因的扩增
• 1.4 小肽双功能酶基因连入表达载体pGEX-2T 中
• 1.5 重组子的筛选和鉴定
• 1.6 目的蛋白的表达,纯化,酶切
• 1.6.1 目的蛋白的表达
• 1.6.2 融合蛋白的纯化
• 1.6.3 凝血酶切融合蛋白
• 2. 总结
• 参考文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师简介