家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究

论文摘要

丝氨酸蛋白酶（serine protease,SP）是蛋白酶（protease）的重要成员,主要参与蛋白质的降解和合成,其活性调节主要通过丝氨酸蛋白酶抑制剂（serineprotease inhibitor,SPI）来完成,二者都是生物体维持正常生命活动不可缺少的重要蛋白质。丝氨酸蛋白酶和其抑制剂的研究报道,广泛见诸于动物、植物和微生物中。对于家蚕而言,丝氨酸蛋白酶对其生长、发育、蜕皮和变态等生长发育过程十分重要,而丝氨酸蛋白酶抑制剂则参与家蚕的正常生长发育调节,并可能与家蚕的自身防御能力等相关。1961年森田等首次从家蚕中纯化了蛋白酶抑制因子,此后40多年经过众多学者的研究,初步探明了家蚕体中SPI类型,主要包括Kunitz、Serpin、Kazal类等几十种,其中以胰凝乳蛋白酶抑制剂（chymotrypsin inhibitor,CI）研究最为详细。日本藤井博研究小组经过长期努力,发现了家蚕至少存在16种CIs,并分别进行了命名。同时,也探明了其遗传规律、连锁群定位,特别是对主要家蚕CI种类的分离、纯化、理化性质和部分CI的基因结构以及可能的功能等进行了探讨,所取得的结果成为家蚕SPI,甚至昆虫蛋白酶抑制剂研究的重要模式。尽管如此,迄今为止有关家蚕SPI的研究,主要还是停留在生化遗传学层面,一些重要的科学问题,例如家蚕SPI（CI）的遗传多态性、基因和基因结构、表达特征、遗传进化关系和功能等,仍然十分模糊。为此,本研究在家蚕基因组计划的基础上,利用家蚕遗传和生物信息学资源两个平台,以家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶抑制剂（trypsin inhibitor,TI）为主,对家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂进行了系统分析,主要内容包括家蚕CI遗传多态性、CI的分离、纯化和基因克隆、家蚕SP和SPI的全基因组鉴定和表达特征,以及家蚕重要TI的基因克隆和功能分析等。取得的主要研究结果如下:1.家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性研究为了系统探明家蚕CI的遗传多态性和分布特征,我们首先对家蚕基因库保存的434个家蚕品系血液样品进行了调查,发现了由Ict-A、Ict-E、Ict-D、Ict-B、Ict-H五种基因支配的全部18种CIs,同时还发现了过去少有报道的Ict-B基因编码的CI-9和CI-10,以及未见报道的未知遗传基因编码的CI-5、CI-11和CI-12等种类。调查发现,所有的品系至少分别拥有由Ict-A和Ict-D二个基因所编码的CI的一种,推测Ict-A、Ict-D为家蚕所必需。9个品系中未检查到由Ict-B和Ict-H两个基因编码的CI种类,推测它们为非必需基因。过去认为Ict-E基因也是家蚕必需基因,根据我们实验结果,发现了少数个体缺乏Ict-E基因编码的CI-3和CI-4。因此,Ict-E基因也可能是家蚕非必需基因。分析家蚕52个纯系品系,发现多数CI种类在不同地理品系中的总体分布特征比较一致,但个别种类存在系统特异性。如CI-4和CI-9在中国系统中出现的频率较日本系统的高,而12个日本纯系品系家蚕都未检测到CI-4;CI-8在中国地方品种中含量低（7%）。聚类分析结果表明家蚕CI分布虽然没有明显的规律性,但来源相同的品系仍然有先聚在一起的趋势。调查表明,不同的家蚕CI种类表达具有明显的组织和时期特异性,其中以CI-8和CI-13最为典型,它们可出现在整个生长发育过程和各个组织器官中,推测其参与了家蚕的胚胎发育、幼虫生长、组织形成、蜕皮和变态发育过程。2.家蚕胰蛋白酶抑制剂的多态性研究首次调查了家蚕TI分布,在375个品系中共发现了9种TIs。特别是丝腺只特异表达TI无CI的现象,而主要在5龄幼虫到结茧时期的中部丝腺检测到活性,暗示其可能通过抑制丝腺的蛋白水解活性从而保护丝蛋白,或在组织溶解过程中发挥作用。统计80个中国和日本系统的TI分布,发现TI-4在中国系统中出现的频率高,而TI-b3主要存在于日本品系中,表明个别TI存在系统特异性。3.家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂（CI-9）的分离纯化、理化性质和基因克隆研究以尚未纯化的高比活性CI-9为目标,经过反复摸索,建立了以硫酸铵沉淀、Butyl-Toyopear1650M疏水层析、2次Sephadex G-50凝胶过滤层析和Chymotrypsin-Sepharose4B亲和层析为主要步骤的纯化方法,并最终从b40品系中获得了单一的活性稳定的CI-9样品,其纯化效率为比活性1819倍,绝对回收率为4%。TOFMass测定CI-9的分子量为7176Da,理化性质测定结果显示其对温度（～100℃）和pH（pH1～12）稳定,等电点（pI）为4.3。N末端氨基酸序列分析获得40个残基序列,发现该抑制剂活性中心为AYF,为一种新类型低分子Kunitz型CI。克隆获得了编码CI-9的基因片段,长度为598 bp,并至少含有一个内含子。经信息分析,得知CI-9由62个氨基酸残基组成。4.家蚕丝氨酸蛋白酶的全基因组鉴定分析以家蚕全基因组精细图谱为基础,对家蚕丝氨酸蛋白酶进行了鉴定。共鉴定了143个家蚕丝氨酸蛋白酶基因,命名为BmSP1～BmSP143,其中有80（55.9%）个基因具有ESTs证据。这些基因中,除20个基因已经被报道或登录外,其余123个为新鉴定基因。信息分析发现这些基因所编码蛋白的分子量从数kDa到数百kDa,等电点从3.5～11不等。143个基因中,51个具有包括Ser、His和Asp残基的完整活性位点,其余具有非完整的活性位点。染色体定位结果,有128个基因能定位到家蚕的26条染色体上,且分布不均匀。第5号、7号和16号染色体拥有较多的基因,分别为11、13、10个。特别是,家蚕丝氨酸蛋白酶基因具有串联重复分布现象,如BmSP74、BmSP143、BmSP18、BmSP142、BmSP103、BmSP40、BmSP53和BmSP39等8个基因在16号染色体上呈串联重复分布,且基因序列相似,估计来源于基因的重复事件。5.家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂的全基因组鉴定分析分析发现,在家蚕基因组中至少存在56种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因,系统命名为:BmSPI1～BmSPI56,且49个（87.5%）基因具有ESTs证据。56个基因中有18个与已报道的基因序列一致或者高度相似,其余38个为新鉴定SPI基因。共计有49个基因都能定位到染色体上,分布同样不匀:第3号、第22号和第28号染色体,分别拥有10、6、7个基因,并且在第2、3、7、15、22和28号染色体上发现了串联重复群,分别含有2～8个序列相似、来自于基因重复的成员。特别重要的是,通过信息分析鉴定了藤井发现的Ict-A、Ict-B、Ict-D、Ict-E和Ict-H五个遗传位点所对应的基因组序列,其对应关系为:BmSPI48对应Ict-A,BmSPI54对应Ict-B,BmSPI40对应Ict-D,BmSPI38对应Ict-E,BmSPI55对应Ict-H。尤其是,根据遗传分析发现Ict-A、Ict-B和Ict-H三个位点来自于相同祖先,各位点分别至少拥有2、2和3个重复基因。以基因组信息为基础,我们推测Ict-H位点在所有位点中变异最活跃,其功能也正在发生分化,而Ict-A为3个位点中唯一的必须基因位点,进化历史最为古老。6.家蚕丝氨酸蛋白酶及其抑制剂的表达特征分析利用家蚕全基因组芯片和表达图谱数据,对56个家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂中有探针的39个基因的表达进行了分析,发现家蚕SPI的表达具有组织和发育时期特异性:凡是含有KunitzBPTI、Zonapellucida和Thyroglobulin1功能域的CIs在各组织的表达量均极低,而含有I-set功能域的BmSPI22则在多个组织器官中均呈现高丰度表达,5个含有Kazal功能域的丝氨酸蛋白酶抑制剂主要集中表达于头、表皮及血细胞等组织器官中等。分析还发现了CI-8在马氏管特异表达,而BmSPI24、BmSPI9、BmSPI19和BmSPI29则在丝腺特异表达,可能意味着它们分别与免疫和丝蛋白合成有密切的联系。特别重要的是,对第2、3、7、15、22、23、25和28号染色体上10个重复基因群进行分析表明,凡是属于来自于同一个基因重复事件的基因,它们都具有非常一致的表达特征,例外极少。进一步说明家蚕SPI丰富的多态性来自于基因重复,同一重复群的基因序列和表达特征相似,可能具有相同的功能。同样,对107个家蚕丝氨酸蛋白酶基因进行了表达图谱分析,发现了5种典型的组织和器官特异表达模式,而在发育变态过程中的模式主要分为两类,一类是整个发育变态过程遍在表达,一类是仅在化蛹前表达。但与家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因显著不同的是,其重复基因群并不具有相同的表达模式,反之亦然,具有相同表达模式的并不是重复基因群。7.家蚕丝氨酸蛋白酶及抑制剂的微生物诱导表达特征分析为了分析家蚕丝氨酸蛋白酶及其抑制剂与家蚕病原微生物抵抗之间的可能关系,我们分别利用大肠杆菌（E.coli）、细菌黑胸败血菌（B.thuringiensis）、白僵菌（B.bassiana）和家蚕NPV病毒进行感染诱导,并分析了表达谱的变化。结果显示,有25个丝氨酸蛋白酶基因和15个抑制剂基因诱导上调表达。有趣的是,BmSPI9对大肠杆菌和白僵菌诱导特别敏感,而BmSPI17对于NPV的诱导敏感,由此推测这两个基因可能与家蚕的防御体系具有十分重要的功能。8.丝腺特异表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆及原核表达为了进一步分析丝腺特异表达的BmSPI9、BmSPI19和BmSPI29三个基因,我们首先利用RT-PCR分析了三个基因的组织表达谱。结果显示,BmSPI9除在体壁中有表达外,主要集中在整个丝腺表达;BmSPI19主要集中在中部丝腺表达,以中部丝腺后段表达量最高;而BmSPI29则只在中部丝腺前段部位表达。其次,我们对该三个基因进行了TA克隆,获得了全长cDNA序列。同时构建了BmSPI29基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了目的蛋白,经分离纯化,获得了较纯BmSPI29蛋白样品。丝腺是家蚕合成丝蛋白的唯一器官,我们期待通过其特异的丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究,为探索丝蛋白合成相关的分子机制提供帮助。9.主要鳞翅目昆虫胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分析对棉铃虫、菜粉蝶等20余种主要鳞翅目害虫的血液和18个蓖麻蚕品种的血液以及不同组织的CI和TI种类分布进行了初步调查,并与家蚕的CI和TI种类进行了比较。发现野外鳞翅目害虫所含的CI大多集中在等电点4.5～9.0之间,物种间的CI种类存在丰富的多态性。蓖麻蚕血液中检测到11种CIs和12种TIs,且CI分布在品种间无明显的多态性,而其TI的种类较家蚕多且品系间存在丰富的多态性,不论是CI还是TI其表达量都较家蚕高,可能是形成蓖麻蚕较强的抗逆、抗病能力的原因之一。本研究获得的鳞翅目昆虫CI和TI的分布信息将为进一步研究各种CI的功能和害虫的生物防治提供很有价值的线索。

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摘要

ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 蛋白酶抑制剂的功能和分类

1.1.1 经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.1.2 非经典类丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.1.3 Serpin类抑制剂

1.2 植物丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.3 动物丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.3.1 昆虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.3.2 其他动物的丝氨酸蛋白酶抑制剂

1.4 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

1.4.1 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂

1.4.2 家蚕胰蛋白酶抑制剂

1.5 丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用研究

1.5.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂在医学上的应用

1.5.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂在农业中的应用

第二章引言

2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂对家蚕生长发育的重要作用

2.2 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂具有十分丰富的遗传多态性

2.3 家蚕CI具有典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域

2.4 家蚕CI的生理功能还不十分明确

2.5 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂还可能具有特殊的功能

2.6 家蚕基因组计划推进了家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究

2.7 科学问题和主要研究内容

2.8 研究思路和技术路线

第三章家蚕血液中丝氨酸蛋白酶抑制剂的多态性研究

3.1 材料和方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂调查

3.2.2 家蚕胰蛋白酶抑制剂调查

3.3 讨论

3.3.1 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性和必需种类

3.3.2 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性与品种的关系

3.3.3 家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂活性变化具有比较明显的时期和组织特异性

3.3.4 家蚕胰蛋白酶抑制剂多态性分析

第四章家蚕血液中胰凝乳蛋白酶抑制剂（CI-9）的分离纯化、理化性质和基因克隆研究

4.1 材料和方法

4.1.1 实验材料及仪器试剂

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 CI-9分离纯化理想品系筛选

4.2.2 CI-9的分离纯化

4.2.3 CI-9的纯度检测

4.2.4 CI-9各个纯化过程中的蛋白质染色和活性染色电泳图谱

4.2.5 分离和纯化效率测定

4.2.6 分子量

4.2.7 温度稳定性

4.2.8 pH稳定性

4.2.9 等电点

4.2.10 N末端氨基酸序列分析

4.2.11 CI-9 cDNA克隆和基因组序列分析

4.2.12 家蚕CI基因的基因组序列克隆

4.3 讨论

第五章家蚕丝氨酸蛋白酶及其抑制剂的全基因组鉴定分析

5.1 材料和方法

5.1.1 数据来源

5.1.2 序列比对

5.1.3 进化分析

5.2 结果与分析

5.2.1 家蚕丝氨酸蛋白酶基因的鉴定

5.2.2 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的鉴定

5.2.3 家蚕丝氨酸蛋白酶和抑制剂基因的基因组分布

5.2.4 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的串联分布

5.2.5 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的进化关系

5.3 讨论

5.3.1 家蚕丝氨酸蛋白酶家族

5.3.2 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂家族

5.3.3 家蚕丝氨酸蛋白酶和其抑制剂基因之间的关系

第六章家蚕丝氨酸蛋白酶及其抑制剂的表达特征分析

6.1 材料和方法

6.1.1 家蚕全基因组芯片

6.1.2 RNA抽提和纯化

6.1.3 芯片杂交

6.1.4 数据处理

6.2 结果与分析

6.2.1 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达特征分析

6.2.2 家蚕丝氨酸蛋白酶的表达特征分析

6.2.3 家蚕丝氨酸蛋白酶的微生物诱导表达

6.2.4 家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂的微生物诱导表达

6.3 讨论

第七章丝腺特异表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的克隆及原核表达

7.1 材料和方法

7.1.1 材料

7.1.2 试剂

7.1.3 仪器

7.1.4 方法

7.2 结果与分析

7.2.1 丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的RT-PCR分析

7.2.2 丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的T-A克隆

7.2.3 家蚕丝腺特异高量表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列结构及功能域分析

7.2.4 BmSPI29重组表达质粒的构建及诱导表达

7.3 讨论

第八章主要鳞翅目昆虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的调查研究

8.1 材料和方法

8.1.1 材料和试剂

8.1.2 实验方法

8.2 结果与分析

8.2.1 主要鳞翅目昆虫胰凝乳蛋白酶抑制剂种类调查

8.2.2 蓖麻蚕主要组织器官中胰凝乳蛋白酶抑制剂的研究

8.2.3 蓖麻蚕不同组织器官中胰蛋白酶抑制剂的调查

8.3 讨论

第九章综合与结论

论文的创新点

参考文献

附录

博士在读期间发表文章及参研课题情况

致谢

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂研究

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