黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的鉴定及分子检测

论文摘要

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是葫芦科重要种传病毒之一，所引起的损失对葫芦科作物生产影响巨大。该病毒属我国潜在危险性有害生物，目前口岸植物检疫部门常有截获，在国内少数地区新近发现。该病毒是通过国际种子贸易、国内的种子调运进行远距离传播。因此，如何快速准确地从进境种子中检测出该病毒是目前急需解决的问题。本研究开展了CGMMV病毒的鉴定及分子检测方法研究等工作，为解决该问题提供了借鉴。主要试验结果如下：（1）以广西南宁一温室的黄瓜病叶为材料，经汁液摩擦接种、透射电镜观察、DAS-ELISA和RT-PCR方法，在该温室黄瓜病叶上检测到黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）。（2）在对RT-PCR反应体系及扩增程序进行了优化的基础上，建立了免疫捕获RT-PCR（IC-RT-PCR）的分子检测方法。我们把该分离物扩增到的CP基因进行T-A克隆，经核苷酸序列分析表明，该分离物CP基因全长为486个核苷酸，编码由161个氨基酸组成、理论分子量为17.3kDa的蛋白，与国内外己报道的CGMMV的CP基因相比，其核苷酸序列的同源性为91.4％～99.4％，其推导的氨基酸同源性为98.8％～100％。（3）设计6对引物，扩增经苋色藜单个枯斑接种葫芦病叶的编码区核苷酸序列。经克隆、测序后，对6段核苷酸序列进行拼接，结果发现该分离物的编码区全长为6188个核苷酸，编码1144个氨基酸。与国外已报道的CGMMV相比，核苷酸序列的同源性为60.1％～98.2％，由此推导的氨基酸同源性为58.4％～99.0％。（4）运用建立的IC-RT-PCR方法直接检测带毒种子，结果发现该方法能从带毒种子中直接检测出CGMMV，比RT-PCR方法操作更为简便，特异性更强。为检疫部门提供了从带毒种子中快速、准确检测该病毒的方法，很有应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 CGMMV的病毒特征及株系研究
• 1.2 CGMMV症状特征
• 1.3 CGMMV基因组结构及功能
• 1.3.1 CGMMV的基因组结构
• 1.3.1 CGMMV的基因组功能
• 1.4 CGMMV的检测
• 1.4.1 生物学检测
• 1.4.2 血清学技术
• 1.4.3 分子生物学技术
• 1.5 病毒病害的防治
• 1.5.1 种子处理
• 1.5.2 抗病育种
• 1.5.3 生物制剂
• 1.6 本研究的目的及意义
• 2.材料与方法
• 2.1 供试毒源
• 2.2 供试试剂
• 2.3 所用仪器设备
• 2.4 黄瓜病叶中CGMMV的鉴定及检测
• 2.4.1 血清学检测
• 2.4.2 生物学鉴定
• 2.4.3 电子显微镜观察
• 2.4.4 RT-PCR检测
• 2.4.4.1 病叶总RNA的提取
• 2.4.4.2 引物设计合成
• 2.4.4.3 反转录（RT）
• 2.4.4.4 PCR扩增
• 2.4.5 常规RT-PCR条件优化
• 2.4.5.1 退火温度的优化
• 2+用量的优化'>2.4.5.2 Mg²⁺用量的优化
• 2.4.5.3 Taq酶用量的优化
• 2.4.5.4 引物浓度的优化
• 2.4.6 IC-RT-PCR检测
• 2.4.7 One-step RT-PCR检测
• 2.4.8 CP基因的克隆与测序
• 2.4.8.1 目的片段DNA的纯化
• 2.4.8.2 T-A连接
• 2.4.8.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2的转化'>2.4.8.4 CaCl₂的转化
• 2.4.8.5 重组克隆的鉴定
• 2.4.8.6 酶切鉴定
• 2.4.9 CP基因序列差异分析
• 2.5 黄瓜病叶分离物CGMMV编码区序列测定与差异分析
• 2.5.1 引物的设计
• 2.5.2 IC-RT-PCR扩增
• 2.5.3 目的片段的克隆、测序与序列差异分析
• 2.6 种子中CGMMV的检测
• 2.6.1 血清学检测
• 2.6.2 种子中总RNA的提取
• 2.6.3 RT-PCR方法检测
• 2.6.4 IC-RT-PCR方法检测
• 2.6.5 CP基因的克隆与序列差异分析
• 3.结果与分析
• 3.1 黄瓜病叶中CGMMV的鉴定和检测
• 3.1.1 血清学检测结果
• 3.1.2 生物学鉴定结果
• 3.1.3 病毒粒子的电子显微镜观察结果
• 3.1.4 目的基因的RT-PCR检测结果
• 3.1.5 常规RT-PCR条件的优化结果
• 3.1.6 目的基因的IC-RT-PCR的检测结果
• 3.1.7 One-step RT-PCR检测结果
• 3.1.8 CP基因的克隆与序列差异分析
• 3.1.8.1 重组质粒的鉴定
• 3.1.8.2 插入片段CP基因序列差异分析
• 3.2 黄瓜病叶分离物CGMMV编码区序列测定与差异分析
• 3.2.1 IC-RT-PCR扩增结果
• 3.2.2 CGMMV编码区目的片段的克隆与序列差异分析
• 3.2.3 插入片断的核苷酸序列差异分析
• 3.3 种子中CGMMV的检测
• 3.3.1 血清学检测
• 3.3.2 RT-PCR检测结果
• 3.3.3 IC-RT-PCR检测结果
• 3.3.4 CP基因的克隆与序列差异分析
• 3.3.4.1 重组质粒的鉴定
• 3.3.4.2 插入片段的序列差异分析
• 4.讨论
• 参考文献
• 附录1 缓冲液的配制
• 附录2 缩写词和英汉对照
• 附录3 DAS-ELISA数据处理及结果判断
• 附录4 本研究中引用的病毒分离物来源
• 致谢