论文摘要
研究背景：冠状动脉粥样硬化性心脏病是指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞,或因冠状动脉功能改变导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病,通称为冠状动脉性心脏病（CHD）,简称冠心病。流行病学调查结果表明,CHD已经成为人类死亡的主要原因之一。在欧美国家,因患CHD死亡的人数占人口死亡数的1/3-1/2。而在我国,近年来CHD发病呈增长趋势,加上我国人口基数大,该如何控制和治疗CHD患者病情的发展,是一个亟待解决的问题。动脉粥样硬化（Atherosclerosis, AS）是心脑血管疾病的重要病理基础,也是代谢综合症的一个重要枢纽,动脉管壁增厚、失去弹性和管腔缩小是各种AS的共同特点。流行病学和临床研究表明：AS主要发生在40岁以上的中老年人群,49岁以后进展较快,但在一些青壮年人甚至儿童的尸检中,也曾发现他们的动脉有早期的粥样硬化病变。CHD是AS发展的结果,是严重危害人类健康的常见病。此外,就目前临床治疗而言,尽管他汀类药物能显著缓解AS的发生发展,但其依然未能完全抑制和逆转AS病情的恶化。因此,探索AS发病的分子调控机制及确证新的药物靶点,对进一步阐明AS的发病机理、开发新的治疗药物,均具有重要的基础研究意义和应用开发价值。FGF21是一个具有210个氨基酸残基的多肽,主要表达于肝脏和脂肪组织。近期的研究发现：在病理和生理的条件下,FGF21直接参与调节机体内脂质和糖的代谢过程,并与脂、糖代谢紊乱所引发的一系列代谢综合症密切相关。此外,动物及临床研究还发现：FGF21不仅与多种肥胖引发的代谢综合征的发病密切相关,更为重要的是,体外给予FGF21治疗能显著降低糖尿病动物体内心血管疾病危险因子的水平。然而,就FGF21与冠心病的研究而言,无论是动物还是临床方面,都知之甚少。脂质代谢紊乱是AS发病的主要机制之一,而高血糖则是AS发病的高风险因素之一,但FGF21是否与AS发病相关?它通过哪些途径调节体内的代谢过程?这些均有待于进一步深入探索。目的：本研究旨在探索AS发病的新的分子机制,通过观察FGF21在CHD临床患者及apoE基因敲除（apoE KO）动物中的表现、外源性FGF21对apoE KO小鼠动脉粥样硬化病变的影响以及体外细胞分子作用机制等方面的研究,深入揭示FGF21在动脉粥样硬化发病过程中所扮演的角色及其分子作用机制。方法：1.根据WHO发布的冠心病的临床诊断标准（1999年度）,我们收集了135例CHD患者及61例年龄性别相匹配的正常对照人群的各种临床资料及血样标本,采用酶联免疫法（ELISA）检测FGF21的血清学浓度在CHD患者与正常对照人群之间的变化状况,同时采用统计学方法,计算分析FGF21血清学浓度与CHD各临床生化指标、机体指数和各危险因子之间的关系。2.以8周龄apoE KO小鼠为研究对象,通过高脂饮食加速诱导apoE KO小鼠的动脉血管粥样硬化病变模型,定期收集小鼠血样标本,采用ELISA技术检测FGF21蛋白血清水平的变化状况,同时采用定量PCR和免疫组化技术,检测血管组织、升主动脉弓、肝脏等相关组织中FGF21基因的表达状况。以此同时,apoE KO小鼠形成动脉血管粥样硬化病变模型后,按40mg/kg·d的剂量给予普伐他汀处理。收集12及24周龄小鼠血样标本,采用ELISA技术检测FGF21血清水平的变化状况,同时采用定量PCR技术,观察血管组织及肝脏组织中FGF21表达的变化状况。3.取8周龄ApoE KO小鼠为研究对象,分别按100和400μg/kg剂量以皮下注射的方式注射重组FGF21蛋白,同时设立生理盐水实验对照组。在FGF21给药过程中,每周对小鼠体重监测一次,观察体重变化。给药6周后处死老鼠,收集小鼠血样标本,分离血清,观察血脂及其它相关指标的变化状况,并收集主动脉、主动脉弓、肝脏等各种组织,采用Western Blot、荧光定量PCR、免疫组化等方法技术,分别从组织形态学、分子生物学等方面评价FGF21对apoE KO小鼠血管及肝脏组织病变的影响。4.采用离体细胞培养模式,观察重组FGF21对血管内皮细胞和巨噬细胞分子生理特性及相关信号通路的影响。（1）观察oxLDL对HUVEC中FGF21表达的影响；（2）观察FGF21对HUVEC中PON1表达的影响；（3）观察FGF21对THP-1源性巨噬细胞脂质堆积的影响；（4）观察FGF21对HUVEC、THP-1-源性巨噬细胞的磷酸化信号分子表达的影响。结果1.CHD患者血清中的FGF21蛋白表达水平显著上升（1）与正常对照人群相比较,CHD患者血清FGF21表达水平显著升高（513.5±47.5 vs 167.9±15.6ng/l,p<0.0001）；（2）在伴有糖尿病、高血压等并发症的CHD患者中,血清FGF21水平显著高于没有这些并发症的患者（各组p<0.05）；（3）以BMI、年龄、性别、糖尿病和高血压为参数校正后,血清FGF21水平与CHD患者的甘油三酯、空腹血糖、载脂蛋白B100、胰岛素和胰岛素抵抗指数呈正相关；而与HDL、载脂蛋白AI呈负相关；（4）多重线性回归分析显示：在CHD患者中,血清FGF21水平变化与甘油三脂和载脂蛋白AI独立相关。2.FGF21的表达水平与apoE KO小鼠动脉粥样硬化病变状况相关（1）FGF21在apoEKO小鼠AS病变过程中显著上调①8周龄apoE KO小鼠的血清FGF21循环水平处于较低的状况,随着病变状况的加重,FGF21循环水平显著升高；②与遗传背景和年龄相同的野生型（WT）小鼠相比,在24周龄的动脉粥样硬化小鼠模型中,在肝脏、主动脉血管组织、肾脏、脾脏等相关组织中,FGF21 mRNA表达显著升高,与其它组织相比,肝脏及主动脉血管组织的表达较高；③在24周龄apoE KO小鼠的血管组织中FGF21 mRNA的表达显著高于对照组WT小鼠；免疫印迹技术检测也得到相似的结果；此外,免疫组化结果表明,FGF21在apoEKO小鼠肝脏的表达显著高于对照组WT小鼠。（2）普伐他汀降低apoE KO血管病变小鼠的FGF21表达①12周龄的apoE KO小鼠血清FGF21水平显著上升,但随着普伐他汀给药（40mg/kg·d）处理12周后,血清FGF21的水平显著下降（P<0.05）；②普伐他汀处理12周后,与HFD阳性对照组相比较,肝脏组织中FGF21mRNA表达水平显著下降（p<0.05）,而在肾脏组织中FGF21 mRNA表达水平则出现上升的现象,但与HFD阳性对照组相比不存在显著差异。③与对照组相比,PON1在apoEKO小鼠心血管病变组织中的表达显著上调；普伐他汀治疗降低了PON1在apoEKO小鼠动脉血管组织中的表达。3.重组FGF21缓解apoE KO小鼠动脉粥样硬化病变的进展（1）FGF21处理能显著减缓apoE KO小鼠的体重增长；同时,FGF21处理能降低apoE KO小鼠肝脏组织的重量以及肝脏/体重比值,并呈现剂量依赖效应。（2）FGF21处理能显著改善apoE KO小鼠的异常血脂状况：FGF21处理能显著降低apoE KO小鼠血清甘油三脂、低密度脂蛋白、游离脂肪酸水平以及总胆固醇的含量,同时上调高密度脂蛋白血清水平。（3）FGF21处理对apoE KO小鼠肝脏脂肪代谢产生直接的影响：①FGF21处理能显著减轻甘油三酯、游离脂肪酸在apoE KO小鼠肝脏组织中的堆积；②FGF21处理将加速apoE KO小鼠肝脏脂肪氧化、抑制脂肪生成,同时调控胆固醇和胆汁酸代谢；③FGF21能减轻高脂饮食及脂质代谢混乱对肝脏组织的损害作用；④FGF21处理能显著减轻肝脏糖原的堆积；⑤FGF21处理显著下调p-p38和p-JNK等信号分子的表达。（4）与对照组apoE KO小鼠相比,FGF21处理组能显著上调小肠ABCA1、ABCG1基因mRNA的表达水平；（5）FGF21抑制apoE KO小鼠动脉粥样硬化病变的发展：①FGF21处理能抑制apoE KO小鼠的血管内膜的增厚；②FGF21处理能减小apoE KO小鼠硬化病变斑块的面积；③FGF21处理能降低ICAM-1在血管内膜中的表达。4.FGF21对HUVEC、THP-1源性巨噬细胞的作用（1）在oxLDL作用下,FGF21表达随oxLDL剂量浓度增加而上升；此外,随着oxLDL处理时间的延长,FGF21的表达水平也呈上升的趋势；（2） PON1在HUVEC中的表达与FGF21剂量及作用时间呈剂量和时间的依赖关系,并与ERK1/2信号通路密切相关；（3） FGF21能抑制紫杉醇诱发的Caspase-3和Caspase-8活性上升,从而抑制紫杉醇诱发的HUVEC凋亡；（4） FGF21处理能促使THP-1源性巨噬细胞内积聚的脂质流出,减少脂质在巨噬细胞中的堆积；（5） FGF21作用HUVEC 20min后,引发包括p38α、ERK1/2、JNK、GSK-3α/β等在内的13种磷酸化蛋白激酶的表达上调；在THP-1-源性巨噬细胞中,FGF21处理后能上调包括p38α、Paxillin、Akt和Lyn在内的7种磷酸化蛋白激酶的表达。结论1.血清FGF21循环水平在冠心病患者中显著升高,并与异常血脂水平密切相关；2. FGF21在apoE KO动脉粥样硬化小鼠模型中显著上升,在肝脏及血管组织中,均有较高的表达。普伐他汀治疗直接影响高脂饮食诱导的apoEKO动脉粥样硬化小鼠的FGF21表达；3.重组FGF21显著减缓apoE KO小鼠体重增长及高脂饮食和apoE基因缺失所引发的相关病变状况。4. HUVEC也是FGF21表达的一种细胞,同时外源性FGF21能通过ERK1/2信号途径上调PON1在HUVEC细胞中的表达,并对紫杉醇所引发的细胞凋亡有一定的抑制作用。此外,FGF21能直接引发HUVEC、THP-1源性巨噬细胞中多种磷酸化信号基因的表达。
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