SARS冠状病毒N蛋白与病毒前导RNA相互作用的初步研究

论文摘要

SARS冠状病毒（SARS—CoV）是一种新型的冠状病毒,其基因组大小约为30,000nt,为单股正链RNA。病毒基因中的1-72个核苷酸为前导序列。核衣壳（Nucleocapsid,N）蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白,它在病毒基因转录、翻译以及病毒颗粒包装中起重要作用。以前对鼠肝炎病毒（Mouse hepatitis virus,MHV）的研究表明,N蛋白在发挥重要作用时,都离不开与病毒RNA的相互作用。N蛋白的中的丝氨酸和精氨酸富集区（SR-Rich region）可以和病毒RNA 5’端的前导序列（RNA leader sequence）发生特异性的结合。其中前导序列中的UCUAA保守序列对结合起关键作用。对比MHV和SARS-CoV的序列,在SARS-CoV中,N蛋白也存在一段SR-Rich区域,前导序列中也有UCUAA保守序列。因此,我们预测这两个区域为病毒N蛋白和RNA结合的关键序列,他们的结合可能在病毒颗粒的组装中发挥重要的作用。 本研究中,我们通过PCR的方法从SARS-CoV的cDNA中克隆出N基因,将N基因及其片断的基因克隆到大肠杆菌表达载体中经诱导表达获得大量的重组蛋白,通过亲和层析和凝胶过滤层析得到高纯度的蛋白;同时构建前导RNA的转录模板,经体外转录得到地高辛（digoxin）标记的RNA。通过重组蛋白在体外与RNA进行结合分析,结果表明,SARS病毒N蛋白在体外可以与病毒前导RNA发生特异性的结合,并且N蛋白中的丝氨酸、精氨酸富集区为结合的主

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 前言
• 1.1 冠状病毒与人类疾病
• 1.2 冠状病毒的生活特征
• 1.3 SARS-CoV基因组的结构与主要蛋白功能
• 1.4 SARS-CoV的遗传进化
• 1.5 SARS-CoV N蛋白的研究进展
• 1.6 冠状病毒前导序列的功能研究
• 第二部分 实验部分
• 第一章 N蛋白及其片断的克隆和前导序列转录模板的构建
• 第一节 N基因的克隆
• 第二节 N蛋白片断的克隆
• 第三节 RNA前导序列转录模板的构建
• 第二章 N蛋白及其片断的诱导表达和纯化
• 第一节 蛋白的诱导表达
• 第二节 可溶蛋白的纯化
• 第三节 包涵体的纯化
• 第四节 蛋白的免疫印迹检测
• 第三章 RNA前导序列的体外转录
• 第四章 蛋白与RNA的结合实验
• 第一节 前导RNA和所有蛋白的结合实验
• 第二节 全长N蛋白和RNA的竞争结合实验
• 全文总结
• 参考文献
• 硕士在读期间发表的文章
• 致谢
• 附录 DNA测序结果