长效融合蛋白GGH的构建、表达、纯化及其初步药效学和药代动力学

论文摘要

胰高血糖素样多肽-1（GLP-1）是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽。体内外研究显示GLP-1具有增强葡萄糖依赖性的胰岛素分泌、减少食物的摄取、减慢胃的排空、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰β细胞增殖、促进胰岛再生、以及抑制胰β细胞的凋亡等功能,且无胰岛素和磺脲类降糖药物的低血糖危险。GLP-1独特的降血糖作用机制,是现有抗糖尿病药物无可比拟的。但在体内其极易被二肽酰基肽酶Ⅳ降解,限制了GLP-1药物化的进展,本论文主要围绕GLP-1的长效性研究展开,主要结论如下:利用PCR的方法克隆获得GLP-1及其突变体GLP-1A2G的基因,并构建了大肠杆菌表达菌株BL21 （pGEX-4T-1-GLP-1）和BL21 (pGEX-4T-1-GLP-1A2G)。SDS-PAGE显示阳性克隆在分子量29.0 kDa处有明显的表达条带,与预测的分子量大小相近。凝血酶酶切后,进一步利用GST亲和层析与分子筛G75纯化获得了目标蛋白GLP-1和GLP-1A2G。小鼠糖耐量实验证明,纯化获得的GLP-1和GLP-1A2G在小鼠体内均有良好的控制血糖的生物活性,并且生物活性基本没有差异。利用生物信息学软件InsightII、ICM pro、Amber计算得出GLP-1的突变体GLP-1A2G与其突变体的串联体(GLP-1A2G)2的合理构象,并完成了其与GLP-1受体的分子对接,主要结合氨基酸残基为V30、L32、V36、Y69和P90,大部分是脂肪族和芳杂环类氨基酸,提示四个配体与nGLP-1R间的相互作用主要为疏水作用,并且计算得出GLP-1和突变体GLP-1A2G的与受体结合能相差不大,而(GLP-1A2G)2与受体结合能大于GLP-1和突变体GLP-1A2G,说明(GLP-1A2G)2较GLP-1A2G更适合与白蛋白融合表达。利用重叠PCR技术,在体外成功拼接获得了(GLP-1A2G)2和HSA的融合基因（GGH）,构建重组表达质粒pPIC9K-GGH,并将其通过电转化法转入毕赤酵母表达系统,经G418抗性筛选得到高表达菌株KM71（pPIC9K-GGH）,在甲醇诱导下其表达量为162 mg/L, western-blot结果表明诱导表达的融合蛋白为GLP-1突变体和HSA的杂合分子。对高表达菌株的发酵过程进行了优化,确定了毕赤酵母KM71（pPIC9K-GGH）的最佳生长条件:温度30℃、pH 6.0、装液量50-60 mL、甘油初始浓度4.0%、蛋白胨浓度2.0%。最佳表达条件:温度30℃、pH 6.0、装液量50-60 mL、诱导甲醇浓度2.0 %。在最优的条件下,毕赤酵母KM71（pPIC9K-GGH）菌体浓度最高达到21.0 g/L、最大比生长速率达到1.70 g/L·h、目标蛋白的最高产量达到245 mg/L、最大比产物生成速率达到3.38 mg/L,并且连续5个批次发酵水平稳定,批次之间的相对误差≤5%。确定了融合蛋白GGH的分离纯化的主要步骤,即10000 r/min离心10 min,分子量10 kDa的biomax超滤膜浓缩20倍,大孔树脂DA101脱色,Q FF离子交换,Sephacryl S-200凝胶层析,整个纯化过程的回收率为50.1%。经SDS-PAGE和HPLC检测纯度大于95%,等电聚集测定等电点为4.6,符合下一步生物活性和药代动力学实验的要求。融合蛋白GGH在体外对胰岛原代细胞生长有较好的刺激作用,在浓度45 nmoL/L时增殖率为35.4%,与单体的GLP-1相差不大。在糖耐量实验中,融合蛋白GGH可以较好的控制小鼠的血糖水平,并且在给药72 h后中、高剂量组仍然有控制血糖的生物活性,而单体的GLP-1在给药4 h后就检测不到生物活性。药代动力学研究表明,融合蛋白GGH在腹腔皮下单次给药8 h左右,血药浓度达到最高,分布容积为53.4 mg/L·h,体内吸收半衰期为26.6 h,体内消除半衰期约为57.8 h。大鼠皮下注射该药后,主要脏器均于6 h达峰,小鼠的胃、肾、肺和肌肉等组织器官中单位重量放射性积聚较高,其中以胃为最高;在肠、胰腺、肝、生殖器和脂肪中单位重量的放射性活度次之,而在心和脑中的分布最少。300 h尿中平均累积排泄率为80.1%,说明肾脏是消除同位素的主要途径,间接反映出该药（包括代谢产物）主要通过肾排泄。300 h粪便中平均累积排泄率为16.0%,说明该药可部分通过粪便排泄。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 糖尿病的发病机理及目前用于治疗糖尿病的药物
• 1.2.1 糖尿病的发病机理
• 1.2.2 目前用于治疗糖尿病药物的研究进展
• 1.3 胰高血糖素样肽-1
• 1.3.1 GLP-1 的合成和分泌
• 1.3.2 GLP-1 的结构与生理功能
• 1.3.3 GLP-1 的受体研究进展
• 1.3.4 GLP-1 的临床应用及其局限性
• 1.3.5 GLP-1 长效性研究
• 1.4 白蛋白融合技术
• 1.5 本论文的研究意义和主要研容
• 第二章 GLP-1 及GLP-1 突变体在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 引物
• 2.1.7 GLP-1 的串联体基因的合成
• 2.1.8 重组表达质粒pGEX-4T-1-GLP-1 或pGEX-4T-1-GLP-1A2G 的构建与鉴定
• 2.1.9 融合蛋白GST-GLP-1 和GST-GLP-1A2G 的诱导表达和纯化[79]
• 2.1.10 GLP-1 和GLP-1A2G 蛋白的纯化[80]
• 2.1.11 GLP-1 及GLP-1A2G 蛋白的生物活性测定[50]
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 GLP-1 与 GLP-1A2G 的基因扩增
• 2.2.2 表达质粒pGEX-4T-1-GLP-1 和pGEX-4T -1-GLP-1A2G 的构建流程
• 2.2.3 表达质粒pGEX-4T -1-GLP-1 和pGEX-4T -1-GLP-1A2G 的基因测序
• 2.2.4 融合蛋白GST-GLP-1 和GST-GLP-1A2G 的诱导表达和纯化
• 2.2.5 GLP-1 及GLP-1A2G 的生物活性测定
• 2.3 本章结论
• 第三章 融合蛋白GGH 在毕赤酵母中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 工具酶
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 主要仪器
• 3.1.6 引物
• 3.1.7 突变体GLP-1A2G分子模型的构建、结构优化及与GLP-1 受体胞外区的对接
• 3.1.8 重组菌KM71（PPIC9K-GGH）的构建与鉴定
• 3.1.9 融合蛋白GGH 的表达
• 3.1.10 发酵液中融合蛋白GGH 的western blot 鉴定[88]
• 3.1.11 发酵液中融合蛋白GGH 的检测
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 突变体GLP-1A2G 分子模型的构建、结构优化及其与GLP-1 受体胞外区的对接
• 3.2.2 （GLP-1A2G）2 和HSA 基因的PCR 扩增
• 3.2.3 （GLP-1A2G）2 基因和HSA 基因的拼接
• 3.2.4 重组表达质粒pPIC9K-GGH 的构建
• 3.2.5 重组表达质粒pPIC9K-GGH 序列的测定
• 3.2.6 重组表达菌株KM71（pPIC9K-GGH）的构建及筛选
• 3.2.7 重组毕赤酵母KM71（PPIC9K-GGH）鉴定
• 3.2.8 融合蛋白的western blot 鉴定
• 3.3 本章结论
• 第四章 营养及环境条件对毕赤酵母KM71（PPIC9K-GGH）生长和表达的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要原料与试剂
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.1.5 分析方法
• 4.1.6 菌株KM71（PPIC9K-GGH）的生长特性
• 4.1.7 菌株KM71（pPIC9K-GGH）的诱导表达特性
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 细胞光密度值（OD600）与细胞干重（DCW）的关系
• 4.2.2 毕赤酵母KM71（pPIC9K-GGH）种龄的确定
• 4.2.3 营养和环境条件对毕赤酵母KM71（pPIC9K-GGH）生长的影响
• 4.2.4 营养和环境条件对毕赤酵母KM71（pPIC9K-GGH）表达的影响
• 4.3 本章结论
• 第五章 融合蛋白GGH 的分离纯化及其生物学活性的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 细胞株与动物
• 5.1.2 材料
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.1.4 融合蛋白GGH 的分离方法
• 5.1.5 纯度检测方法
• 5.1.6 融合蛋白GGH 的生物活性检测
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 融合蛋白GGH 的超滤浓缩
• 5.2.2 融合蛋白GGH 的大孔树脂脱色
• 5.2.3 融合蛋白GGH 的离子交换
• 5.2.4 融合蛋白GGH 的凝胶层析
• 5.2.5 融合蛋白GGH 的纯度鉴定
• 5.2.6 融合蛋白GGH 的纯化过程
• 5.2.7 融合蛋白GGH 的体外活性
• 5.2.8 融合蛋白GGH 的体内活性
• 5.3 本章结论
• 第六章 融合蛋白GGH 在小鼠体内的初步药代动力学研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 主要仪器设备
• 6.1.3 实验动物
• 125I-GGH 的制备'>6.1.4¹²⁵I-GGH 的制备
• 6.1.5 回收及干扰实验
• 6.1.6 血浆药物浓度- 时间曲线的测定及其药物在小鼠体内的分布
• 125I-GGH 的排泄'>6.1.7 小鼠体内¹²⁵I-GGH 的排泄
• 6.1.8 药代动力学参数的计算
• 6.2 结果与讨论
• 125I-GGH 的制备'>6.2.1¹²⁵I-GGH 的制备
• 125I-GGH 生物活性测定'>6.2.2¹²⁵I-GGH 生物活性测定
• 125I-GGH 回收实验'>6.2.3¹²⁵I-GGH 回收实验
• 125I-GGH 血清及组织干扰实验'>6.2.4¹²⁵I-GGH 血清及组织干扰实验
• 6.2.5 血浆药物浓度-时间曲线的测定、药代动力学参数的计算
• 6.2.6 融合蛋白在小鼠体内的组织分布
• 125I-GGH 的排泄'>6.2.7 小鼠体内¹²⁵I-GGH 的排泄
• 6.3 本章结论
• 结论与展望
• 论文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文