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猪肺泡巨噬细胞NRAMP1基因启动子克隆及特异性表达的功能验证

2020-12-11阅读(614)

猪肺泡巨噬细胞NRAMP1基因启动子克隆及特异性表达的功能验证

论文摘要

猪PAM是PRRSV感染的靶细胞。为使抗PRRSV的外源基因在靶细胞中高效、特异性表达,培育出猪的抗PRRS转基因新品系,筛选猪PAM特异表达基因启动子是非常重要的。真核生物基因在无转录因子时,RNA聚合酶自身不能启动转录,故处于不表达状态,只有当转录因子（蛋白质）结合在其识别的DNA序列上后,基因才开始表达。因此,对特异表达基因启动子研究既包括启动子区顺式作用元件确定又包含转录因子调控作用。研究表明猪自然抗性相关巨噬细胞蛋白1（Nramp1）基因mRNA在单核巨噬细胞和肺、脾组织中都可表达,但在巨噬细胞中表达量最高。本研究通过半定量RT-PCR方法进行组织表达谱分析,验证了Nrampl基因为PAM特异表达基因。采用缺失表达载体,研究了Nrampl基因启动子在猪肺泡巨噬细胞、脂肪前体细胞、成纤维细胞和肾细胞的表达活性,获得具有特异性调控能力的核心启动子区。方法如下：1RACE技术确定Nramp1基因的转录起始位点Nramp1基因转录起始位点的确定为研究该基因的转录调控奠定了基础。通过NCBI下载Nramp1基因mRNA序列,并设计5’RACE特异性引物。依据Smarter RACEkit克隆出Nramp1基因5’非翻译区,确定其转录起始位点为A,位于ATG上游90bp处。GenBank登录号为HM754433.2Nrampl基因启动子缺失表达载体构建首先,利用生物信息学方法查找猪Nrampl基因5’调控序列,同时预测出启动子及转录因子结合位点大概位置；其次,应用PCR技术扩增不同长度缺失片段的启动子,分别连接到萤火虫荧光素酶报告基因pGL3-Basic载体上,经酶切、测序鉴定成功构建了八种重组表达载体pLUC1430、pLUC1136、pLUC840、pLUC751、pLUC487、 pLUC379、pLUC274、pLUC179。3缺失启动子活性分析及细胞特异性验证将萤火虫荧光素酶重组表达载体与海肾荧光素酶报告载体按照20：1共转染肺泡巨噬细胞,24小时后,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性,以pRL-TK荧光活性值为内对照,并将pGL3-Basic（?）的基础活性值定为1,分析缺失启动子活性,筛选出核心启动子区为pLUC487。同时瞬时转染其他非巨噬细胞,如猪肾细胞、脂肪前体细胞、猪胎儿成纤维细胞。验证该核心启动子具有细胞特异性,同时筛选出与细胞特异表达相关的调控元件。通过生物信息学分析和实验研究相结合,筛选出Nrampl基因特异表达的核心启动子区pLUC487[-1327～+86],并初步确定Spl. AP-1、c-Ets、C/EBP、(（?）R等转录因子具有特异性转录调控作用。可以利用Nrampl基因核心启动子及重要的转录调控元件在PAM中特异性地启动下游目的基因的表达。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略语中英文对照
  • 引言
  • 参考文献
  • 第一部分 文献综述
  • 第一章 真核生物基因转录水平调控的研究进展
  • 1 真核生物基因转录水平调控概况
  • 2 启动子研究进展
  • 2.1 真核生物启动子类型
  • 2.2 组织特异性启动子
  • 2.3 启动子结构研究方法
  • 2.4 启动子功能研究
  • 3 转录水平的功能验证
  • 4 小结
  • 第二章 NRAMP1基因的研究进展
  • 1 Nramp基因命名
  • 2 Nramp1基因结构与定位
  • 3 Nramp1基因的功能及作用机理
  • 4 Nramp1基因抗病性研究
  • 4.1 Nramp1基因与结核病相关研究
  • 4.2 Nramp1基因与伤寒病相关研究
  • 4.3 Nramp1基因与其他疾病相关研究
  • 5 Nramp1基因表达调控机制及表达特异性研究
  • 5.1 Nramp1基因的表达调控机制
  • 5.2 Nramp1基因细胞和组织表达特异性
  • 6 小结
  • 参考文献
  • 第二部分 实验研究
  • 第三章 猪NRAMP1基因特异性表达研究及转录起始位点确定
  • 1 材料与主要仪器
  • 1.1 实验样品
  • 1.2 实验试剂
  • 1.3 主要溶液及其配制
  • 1.4 主要仪器设备
  • 1.5 网络资源及生物信息学软件
  • 2 实验方法
  • 2.1 猪肺泡巨噬细胞体外培养
  • 2.2 猪Nramp1基因核酸序列的获取
  • 2.3 引物设计
  • 2.4 猪各组织及PAM细胞总RNA提取
  • 2.5 RNA浓度和纯度检测
  • 2.6 Nrampl基因特异性表达研究
  • 2.7 Nramp1基因转录起始位点确定（TSS）
  • 2.8 T-A克隆测序
  • 3 结果与分析
  • 3.1 Nramp1基因mRNA在各组织及PAM中的表达谱分析
  • 3.2 Nramp1基因的转录起始位点确定
  • 4 讨论
  • 5 小结
  • 参考文献
  • 第四章 NRAMP1基因启动子缺失表达载体构建及功能特异性验证
  • 1 材料与主要仪器
  • 1.1 实验样品
  • 1.2 材料与试剂
  • 1.3 常用试剂配制
  • 1.4 主要仪器及相关生物信息网站
  • 2 实验方法
  • 2.1 Nramp1基因启动子缺失表达载体构建
  • 2.2 Nramp1基因启动子活性分析及功能特异性验证
  • 3 结果与分析
  • 3.1 Nramp1基因5’调控区序列获得
  • 3.2 Nramp1基因启动子预测结果
  • 3.3 重组表达载体KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定
  • 3.4 优化的转染条件
  • 3.5 猪Nramp1基因缺失启动子活性分析及功能特异性验证
  • 4 讨论
  • 4.1 关于启动子缺失表达载体构建
  • 4.2 关于细胞培养、转染与双报告基因系统检测
  • 4.3 关于启动子活性调控的研究
  • 5 小结
  • 参考文献
  • 全文总结
  • 附录Ⅰ
  • 附录Ⅱ
  • 附录Ⅲ
  • 致谢

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