论文摘要
阿魏酸酯酶[E.C.3.1.1.73,Ferulic acid esterases, FAE （又称Feruloyl esterase）]作为一种羧酸酯水解酶,其广泛的应用价值逐渐被人们所关注。阿魏酸酯酶可以水解阿魏酸与木质素和半纤维素之间的酯键,使得原料结构疏松,使碳水化合物复合物更易被酶解,从而提高天然木质纤维素原料的降解率；同时,将具有生理活性的物质阿魏酸从植物细胞壁中游离出来。另外,用阿魏酸酯酶处理植物性原料在化妆品、食品、药品以及饲料和造纸工业等中均有着光明的前景。但目前阿魏酸酯酶在工业化应用方面仍然存在着一些问题：（1）阿魏酸酯酶是研究相对较少的一个酶,目前只有一小部分微生物来源的阿魏酸酯酶被鉴定并定性；（2）目前发现的阿魏酸酯酶活性并不能满足工业化的需求；（3）缺少对特殊生产需求具有耐受性的阿魏酸酯酶,比如耐高温或具有高pH稳定性的阿魏酸酯酶。本实验期望从极端耐热性海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8 ATCC43589）中寻找到耐高温的阿魏酸酯酶,并实现此酶的高效表达。本研究首先以极端嗜热菌海栖热袍杆菌（T. maritima MSB8 ATCC43589）作为研究对象,将其基因组中与乳酸菌以及链球菌属来源的阿魏酸酯酶基因具有较高同源性的一段酯酶基因克隆表达,并在含有白色底物阿魏酸乙酯的培养基中进行平板筛选,结果证明此酶具有阿魏酸酯酶的活性,即本论文首次鉴定了海栖热袍杆菌（T. maritima MSB8 ATCC43589）来源的阿魏酸酯酶。本研究对利用新型热激表达载体pHsh系统构建的重组质粒进行了mRNA二级结构优化,然而SDS-PAGE检测结果表明,表达量并没有显著提高,因此尝试利用“非理性设计方法”对蛋白进行定向进化——即利用一种新型的通过原位易错PCR构建随机变文库的方法,并结合高通量的筛选,期望获得表达量提高的突变子。利用原位易错PCR构建随机变文库是本实验室的最新国际专利（US,2012/0004142）,本专利利用来源于海栖热袍菌的极耐热性DNA连接酶（Tmα DNA连接酶）,在传统PCR循环中加入一个连接步骤,即变性—退火—延伸—连接的四步循环法PCR,从而实现环状质粒的PCR指数扩增（PPCP）。当利用Taq DNA聚合酶在易错条件下对表达质粒中的目标基因进行延伸和连接时,则可扩增出带有突变基因的可直接用于转化的环状质粒,实现在表达质粒原位一步构建基因突变文库。由于原位易错PCR中所用引物中含有与模板质粒不同的筛选标记,原位易错PCR产物转化宿主菌后,模板质粒在筛选平板上可被直接剔除。本研究首次使用此专利构建突变文库,试图筛选到高表达量突变子。由于没有掌握最合适的突变频率,没有得到预期突变效果,也可能由于构建的突变文库不够大,导致没有得到高表达量的重组酶。另外,异源阿魏酸酯酶可能对宿主细胞具有一定的毒性,其在大肠杆菌内的大量积累造成了大部分宿主的死亡。这也解释了为什么在42℃热激诱导过后,大肠杆菌细胞密度过低的现象。本实验中又利用了粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe YHL6381）的高效表达系统对阿魏酸酯酶进行了分泌型表达。将来源于粟酒裂殖酵母中编码丝氨酸羧肽酶基因的信号肽cpy与目的基因相连,利用高效的外源蛋白表达载体pADH-GFAT,在gfaA基因营养缺陷型的粟酒裂殖酵母菌中进行了分泌型表达。收集胞外酶液进行酶活测定,同时进行SDS-PAGE检测,结果显示分泌型表达也不适用于此酶,数据显示此酶的蛋白表达量及酶活只有微弱提高。分析原因可能是本实验并未选取到最适合阿魏酸酯酶基因分泌表达的信号肽。
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标签：海栖热袍菌论文; 极耐热性阿魏酸酯酶论文; 重组菌论文; 原位易错论文; 真核系统分泌表达论文;