论文题目: 表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组质粒的构建及免疫效应
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 宋勤叶
导师: 杨汉春
关键词: 疫苗,细胞因子,免疫反应,保护效果
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征及其它相关疾病的病原。本研究应用基因工程技术构建了表达猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(porcine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)、PCV2衣壳蛋白(capsid protein,CP)及共表达CP和GM-CSF的重组质粒,分析了表达PCV2 CP的重组质粒在小鼠和猪诱导的体液和细胞免疫反应,以及表达猪GM-CSF和IL-2的重组质粒对PC2 DNA疫苗免疫效果的调节作用。 采用RT-PCR方法从猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪GM-CSF的cDNA,构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1-gm-csf;用PCR技术扩增出编码PCV2 CP的ORF2基因,构建了重组质粒pcDNA3.1-orf2、pcDNA4-orf2,以及共表达PCV2 CP和猪GM-CSF的重组质粒pIRES-orf2/gm-csf。采用间接免疫荧光试验和集落刺激形成试验证明,在COS7细胞中pcDNA3.1-gm-csf可表达GM-CSF,pcDNA3.1-orf2和pcDNA4-orf2可表达PCV2 CP,pIRES-orf2/gm-csf能同时表达PCV2 CP和GM-CSF。 用重组质粒pcDNA3.1-orf2和pcDNA4-orf2免疫小鼠,分析了免疫小鼠的体液与细胞免疫应答水平。结果表明,经3次肌肉注射后pcDNA3.1-orf2免疫组中80%的小鼠血清特异性抗体转阳,pcDNA4-orf2免疫组中100%的小鼠血清特异性抗体转阳;与对照组相比,pcDNA3.1-orf2免疫组小鼠脾细胞对丝裂原ConA或重组PCV2 CP的刺激反应显著增强,CTL和NK细胞的杀伤活性明显提高;pcDNA4-orf2诱导的细胞免疫反应水平低于pcDNA3.1-orf2;重组质粒免疫小鼠脾脏淋巴细胞中CD3+CD4+CD8-细胞亚群和CD3+CD4-CD8+细胞亚群的百分含量提高。此外,发现肌肉注射和鼻腔接种pcDNA3.1-orf2后诱导的免疫反应没有显著差异。 将7日龄健康仔猪分成5组,分别为空载体(Ⅰ组)、pcDNA3.1-orf2(Ⅱ组)、pcDNA3.1-orf2+pcDNA3.1-gm-csf(Ⅲ组)、pIRES-orf2/gm-csf(Ⅳ组)、pcDNA3.1-orf2+pcDNA3.1-IL-2(Ⅴ组),每组3头,共肌肉注射3次,每次间隔2周。结果表明,各重组质粒免疫组均产生了低滴度的PCV2特异性ELISA抗体和中和抗体,平均中和抗体滴度分别为1:6.7,1:29.3,1:26.7,1:20.2;Ⅳ和Ⅴ组免疫猪外周血淋巴细胞的增殖活性高于Ⅱ组和Ⅲ组;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组免疫猪外周血NK细胞杀伤活性高于Ⅱ组;重组质粒免疫各组的外周血中Th、Tc和m/aTh含量显著高于空载体对照组,其中Ⅴ组的TC含量最高;重组质粒免疫各组的IL-4水平高于空载体对照组,Ⅳ和Ⅴ组IL-12表达水平显著高于Ⅱ和Ⅲ组。第3次免疫后4周经口腔和鼻腔途径接种PCV2 BJ-HB株组织毒。结果表明,各重组质粒免疫组均无体温升高,而且鼻腔和直肠的排毒率和病毒血症阳性率显著低于空载体组,以Ⅴ组的排毒率和病毒血症阳性率最低;经免疫组化和PCR检测结果表明,Ⅴ组的含毒组织检出率最低。由此表明,混合质粒pcDNA3.1-orf2+pcDNA3.1-IL-2(Ⅴ组)的免疫保护效果优于其它重组质粒,重组质粒pcDNA3.1-IL-2可显著改善重组质粒pcDNA3.1-orf2诱导的免疫反应和保护性反应;GM-CSF基因能够增强pcDNA3.1-orf2诱导的体液免疫反应。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
插图和附表清单
缩略词表
第一章 引言
1.1 国内外研究概况
1.2 研究目的与意义
1.3 研究内容与技术路线
1.4 研究目标
第二章 猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的克隆及其真核重组表达质粒的构建
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.3 结果与分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 表达PCV2衣壳蛋白的真核重组质粒的构建
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.3 结果与分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 表达PCV2衣壳蛋白的重组质粒在小鼠体内诱导的免疫反应
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.3 结果与分析
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 表达PCV2衣壳蛋白的重组质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.3 结果与分析
5.4 讨论
5.5小结
第六章 结论
第七章 创新点
第八章 文献综述
8.1 DNA疫苗的历史
8.2 DNA疫苗的优势
8.3 DNA疫苗的免疫机制
8.4 DNA疫苗的构建
8.5 DNA疫苗的接种方法和途径
8.6改善DNA疫苗免疫效果的措施
8.7 DNA疫苗的安全性评价
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-07-18
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