论文摘要
近年来，随着对油料作物油脂代谢相关基因的分离克隆、组织特异性表达启动子等的深入研究，使得利用基因工程技术改变油菜种子代谢途径、改良油菜品质成为可能。从脂肪酸生物合成的链条可以看出，油酸是脂肪酸合成的一个重要代谢分支点，调配着种子中不同脂肪酸的组成和比例。编码Δ12-油酸去饱和酶（delta-12 oleate desaturase FAD2）的fad2基因是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键基因，对fad2基因表达进行抑制，则可使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻。在高芥酸油菜中则加速了油酸生成芥酸的反应，使芥酸的含量随着增高，期望获得接近理论值66％的高芥酸植株。而在低芥酸油菜中，油酸的含量就会大大提高，有可能培育出高油酸、低芥酸油菜品种。近年来，双链RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）在油料作物脂肪酸组成改良方面的研究有了突破性进展。本项研究应用目前沉默效率较高的ihpRNA（intron splicing hpRNA,ihpRNA）干扰技术对甘蓝型油菜的fad2基因进行沉默，进而对油菜种子的油份进行特异性遗传改良，为进一步选育高芥酸或者高油酸油菜品种提供技术和材料基础，丰富和拓展基因沉默技术在植物品质改良方面的理论和实际应用研究。依据ihpRNA介导的RNAi技术的原理，本研究构建了对应于油菜fad2基因的RNAi植物表达载体-pCAMBIA3301-fad2i，并以甘蓝型油菜高芥酸品系Y14-1和双低品系RO2的子叶柄作为主要转化受体，利用根癌农杆菌介导法，将fad2 RNA干扰体基因导入甘蓝型油菜。其中转化高芥酸品系油菜Y14-1，期望获得芥酸进一步升高的抗性植株；转化双低品系油菜RO2，期望获得高油酸抗性植株。主要研究结果如下：1．组成fad2 RNA干扰体5个片段的克隆与分析本研究克隆了5个fad2 RNAi载体组成片段，分别为组成干扰体茎体（Stem）部分的fad2-1和fad2-2两个片段、环体（Loop）部分的豌豆rbcS-3C内含子（83bp）及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段、终止子CaMV 3’UTR，此组成片段分别与pMD18-T载体连接、转化后，挑单克隆菌系用于测序。测序结果与NCBI公布的序列比较，结果表明：所克隆的五个片段序列与其参考序列完全相同，同时表明，采用以总DNA为模板PCR扩增fad2-1、fad2-2这两个片段是可行的。并且与已发表的甘蓝型油菜fad2基因编码区序列的同源性达到90％以上，表明用本实验克隆的fad2片段构建的ihpRNA植物表达载体，有可能诱导甘蓝型油菜fad2基因沉默。2．fad2 RNAi植物表达载体的构建本研究所构建的RNAi植物表达载体实际上是一个ihpRNA结构。选择油菜fad2基因片段（510bp）分别以反向和正向的形式插入到合适启动子下游，并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入一个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子（83bp）及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。启动子选用油菜Napin启动子，可以充分保证其表达的时空特异性与靶基因相同；终止子为来源于pCAMBIA1301质粒的、具有高效终止功能的CaMV 3’UTR序列。3．根癌农杆菌介导的fad2 RNA干扰体基因转化甘蓝型油菜利用根癌农杆菌介导法，对甘蓝型油菜高芥酸品系Y14-1和双低品系RO2的带柄子叶进行fad2 RNA干扰体基因的转化、筛选，生根，移栽，获得了83株转化Y14-1的PPT抗性植株。经GUS组织化学染色检测、PCR扩增检测，确定14株PPT抗性植株为转基因植株To代，并收获T1代种子。利用FOSS公司的MODEL-5000型近红外谷物品质分析仪，对收获的T1代种子样品进行光谱扫描，测定了油菜油脂中芥酸、油酸、亚油酸等脂肪酸含量。初步结果表明：侵染转化高芥酸品种Y14-1后获得的转基因油菜种子，其中芥酸的含量与对照相比有所升高，而棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸基本上均比对照有所降低。这说明利用RNAi干扰fad2基因可以使高芥酸油菜品种的芥酸在理论值范围内有所升高，从而获得期望的高芥酸品种。由于所收获得T1代种子成熟度不够，脂肪酸总量比正常值低，所以还需要对T2代种子重新进行脂肪酸含量检测，期望得出更为准确的分析结果，为在不久的将来培育出高芥酸油菜打好基础。