水稻低植酸突变基因的鉴定与研究

论文摘要

植酸是作物种子中磷元素的主要存在形式,占种子全磷含量的65-85%和酸溶性肌醇磷酸盐的90%以上。植酸通常与K+、Ca2+、Mg2+、或/和Zn2+等离子等金属离子鳌合形成植酸盐,沉积在禾谷类作物的糊粉层和胚中。植酸及植酸盐不能被人和非反刍动物吸收,一方面影响微量元素的生物有效性及对蛋白、脂肪、淀粉的吸收;另一方面,不能被利用的植酸盐随动物粪便排泄入水系导致水体富营养化。降低种子中植酸的含量,为解决与植酸相关的营养和环保问题开辟了一条新途径。本试验中,通过对T-DNA插入突变系的筛选发现了1个低植酸突变体:通过精细定位及对定位区域的分析,克隆了2个非等位的水稻低植酸突变基因;此外,还对低植酸突变体与野生型的产量性状和种子特性进行了相关研究。主要结果总结如下:1、在对引进的7个韩国T-DNA突变系进行Pi检测时发现了1份编号1A-08603的低植酸材料。遗传分析显示,分离群体后代中正常和低植酸籽粒的分离比率为3:1,符合1对基因隐性遗传模式。GUS组织化学染色和PCR检测结果证明,该低植酸性状与T-DNA插入无关,低植酸突变可能是由无性系变异引起。该突变严重影响种子活力,纯合HIP籽粒无法自然发芽。2、KBNT lpal-1被精细定位到2号染色体长臂上的47Kb区域,通过CEL I酶切和基因测序两种方法,没有在定位区域内发现KBNT lpal-1与KBNT之间任何的碱基差异。扩大定位区域范围,对附近的基因按照同样的方法进行分析,结果发现KBNT lpal-1在LOCOs02g57400（TIGR V5）基因外显子区域存在1个SNP（C/G→T/A）,产生了Xsp I限制性内酶切位点。对另一携带等位突变基因的Os-lpa-XQZ的分析发现,突变导致1个1475bp的大片段缺失。据此,分别发展了LPA1CAPS、LPA1InDel 2个分子标记。对KBNT lpal-1/浙733的重组自交系与Os-lpa-XQZ/XQZ F2后代分离群体的PCR分析表明,低植酸性状与各自的标记共分离。对LOC Os02g57400基因预测显示存在4种转录模式,突变对LOCOs02g57400（FGENESH）转录模式影响最大。氨基酸同源性比对分析显示该基因与拟南芥中2-磷酸甘油酸激酶有较高的同源性,且水稻中存在2个同源基因。3、通过籼粳交F2群体,利用BSA法将另一个低植酸突变基因Os-lpa-MH86-1初步定位在RM5478与RM17567之间的350Kb。通过合成定位区域内新的SSR标记,同时根据日本晴和9311之间的差异,发展了一系列InDel和CAPS标记,最终将Os-lpa-MH86-1突变基因定位在CAPS3和ID26之间的112Kb区域内。4、根据Os-lpa-MH86-1精细定位区域内的基因注释（TIGR V5）,排除6个基因后,对其余8个基因进行测序,发现Os-lpa-MH86-1在LOCOs04g55800的第12个外显子上缺失1个碱基G,导致无义突变,蛋白翻译提前终止。另一携带等位突变基因的突变体Os-lpa-Z9B在第1个外显子上缺失6个碱基,导致Lys和Ser的缺失。利用Os-lpa-Z9B等位基因特性标记CAPS-Z对Os-lpa-Z9B/日本晴F2群体分析表明该6bp的缺失与低植酸性状共分离。RT-PCR分析不同组织的时空表达特性显示,LOCOs04g55800在根中不表达,在叶片和种子中的表达较叶鞘高,突变体及野生型在开花后各个时期表达没有太大差异,整体上LOCOs04g55800基因的转录水平较低。氨基酸比对显示LOCOs04g55800在水稻中存在多个同源基因,且普遍存在于植物中,系统进化树分析该基因在双子叶和单子叶分化前已经存在。5、对4个低植酸突变体及其野生型产量性状的比较,发现低植酸突变体的单株产量比野生型下降12.5-25.6%。其中,千粒重下降5.0-10.7%,可能是导致产量减少的重要原因之一。种子发芽试验表明,突变体的简化活力指数下降7.8-26.3%,淀粉酶总活性下降12.6-23.8%,二者的趋势基本一致。人工老化实验表明,低植酸突变体对老化处理的反应更为敏感。田间实验表明,低植酸突变体较亲本存在成苗率下降的趋势。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 表格一览表
• 图一览表
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 植酸简介
• 1.2 植酸的生理功能和生物合成
• 1.2.1 植酸在作物中的含量、贮存形式及分布
• 1.2.2 植酸在植物体内的生理功能
• 1.2.3 植酸的生物合成
• 1.3 植酸的生理效应
• 1.3.1 植酸的抗营养效应
• 1.3.2 植酸的生理效应
• 1.3.3 植酸环境生态效应
• 1.4 降低植酸含量的途径
• 1.4.1 物理方法
• 1.4.2 化学方法
• 1.4.3 植酸酶
• 1.5 低植酸突变体的选育与研究
• 1.5.1 低植酸突变体的选育
• 1.5.2 低植酸突变的类型
• 1.5.3 低植酸突变体的农艺性状及种子特性
• 1.5.4 低植酸突变体的遗传
• 1.5.5 低植酸突变的分子标记及基因定位
• 1.5.6 低植酸突变的分子机制
• 1.6 本文研究的目的及主要内容
• 第二章 一个低植酸水稻突变体的鉴定与遗传分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 HIP籽粒的筛选
• 2.1.3 lpa突变体胚的组织培养
• 2.1.4 突变体的种植
• 2.1.5 DNA提取
• 2.1.6 GUS检测及PCR分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 lpa突变体的发现及特征
• 2.2.2 突变性状的遗传
• 2.2.3 GUS检测及PCR分析
• 2.3 讨论
• 第三章 两个水稻低植酸等位突变基因的克隆
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 HIP表型鉴别
• 3.1.3 DNA提取与基因池的构建
• 3.1.4 lpa1基因定位区域分析
• 3.1.5 CEL I检测
• 3.1.6 候选基因分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 候选基因的鉴定
• 3.2.2 候选基因序列
• 3.2.3 基因内共分离标记在群体中的验证
• 3.2.4 候选基因结构预测
• 3.2.5 候选基因在其他物种和水稻中的同源序列
• 3.3 讨论
• 3.3.1 水稻lpa1候选基因的发现
• 3.3.2 水稻lpa1导致低植酸的可能机理
• 3.3.3 CEL I酶在基因突变检测中的应用
• 3.3.4 CEL I酶在基因精细定位及克隆中的应用
• 3.3.5 lpa1水稻的分子标记辅助选择育种
• 第四章 一个水稻低植酸新基因的精细定位
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料与群体构建
• 4.1.2 HIP表型鉴定、DNA提取与基因池的建立
• 4.1.3 分子标记
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 遗传分析及基因的初步定位
• 4.2.2 InDel标记和CAPS标记开发
• 4.2.3 基因的精细定位
• 4.3 讨论
• 4.3.1 InDel和CAPS标记的开发
• 4.3.2 精细定位群体的大小
• 第五章 一个水稻低植酸基因的克隆及分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 试验材料与群体构建
• 5.1.2 HIP表型鉴别及DNA提取
• 5.1.3 基因扩增测序
• 5.1.4 CAPS标记的设计
• 5.1.5 RT-PCR
• 5.1.6 生物信息学分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 候选区域基因的分析及克隆策略
• 5.2.2 测序结果
• 5.2.3 等位基因特异性标记的验证
• Os04g55800基因结构与突变效应'>5.2.4 LOC_Os04g55800基因结构与突变效应
• Os04g55800基因表达'>5.2.5 LOC_Os04g55800基因表达
• 5.2.6 系统发生与进化分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 诱发突变体在基因克隆中的应用
• 5.3.2 Os-lpa-MH86 1-7突变的来源
• 5.3.3 等位基因特异性标记的应用
• Os04g55800与植酸合成的可能联系'>5.3.4 LOC_Os04g55800与植酸合成的可能联系
• 第六章 低植酸水稻产量及种子特性的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 试验材料
• 6.1.2 材料的处理
• 6.1.3 种子发芽实验
• 6.1.4 淀粉酶活性的测定
• 6.1.5 田间成苗率调查
• 6.1.6 统计方法
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 种子发芽试验
• 6.2.2 种子萌发过程中淀粉酶活性的变化
• 6.2.3 田间成苗率调查
• 6.2.4 突变体与亲本产量性状的比较
• 6.3 讨论
• 参考文献
• 附录