TNF-α对大鼠肺微血管内皮细胞Src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响

论文摘要

目的:研究肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）对培养的大鼠肺微血管内皮细胞（pulmonary microvascular endothelial cell,PMVEC）中Src抑制的蛋白激酶C底物（Src-suppressed C kinase substrate,SSeCKS）表达的影响及甲基强的松龙（甲强龙）对TNF-α所致大鼠PMVEC单层通透性损伤和SSeCKS表达的干预作用。方法:根据TNF-α刺激时间与浓度的差异,将培养的大鼠PMVEC随机分为TNF-α时间刺激组与浓度刺激组,前组以5000 U/ml的TNF-α分别与PMVEC作用0.5h,1.5h,3h,6h,12h;后组分别以200U/ml,1000U/ml,5000U/ml的TNF-α与PMVEC作用3h。药物干预:分别以5000U/ml的TNF-α和0.2mg/ml的甲强龙+5000U/ml的TNF-α与PMVEC作用1.5h。以上均设立正常对照组,运用RT-PCR法及Western-blot法检测SSeCKS mRNA及蛋白的表达变化。用针头式滤器检测TNF-α（5000 U/ml）组及甲强龙（0.2mg/ml）+TNF-α（5000 U/ml）组作用1.5h后大鼠PMVEC单层通透系数（Kf）,以正常PMVEC单层通透性作对照。结果:1.体外成功分离培养出大鼠PMVEC,并经形态学及FITC-PHA结合实验证实。2.通过对正常对照组大鼠PMVEC的RT-PCR法及Western-blot法检测,均发现SSeCKS特异性条带。3.正常情况下大鼠PMVEC低表达SSeCKS。5000U/ml的TNF-α作用PMVEC后,SSeCKS mRNA及蛋白的表达自0.5h开始增高,3h达到高峰,随后渐行性下降但维持较高表达水平至12h,以上各时间点mRNA及蛋白的表达均明显高于正常对照组。表明TNF-α可以时间依赖的方式上调SSeCKS的mRNA及蛋白的表达。4.200 U/ml,1000 U/ml,5000 U/ml的TNF-α作用PMVEC后,SSeCKS mRNA及蛋白的表达依次递增,均明显高于正常对照组。表明TNF-α可以浓度依赖的方式上调SSeCKS的mRNA及蛋白的表达。5.甲强龙+TNF-α组SSeCKS的蛋白表达明显低于TNF-α组,而甲强龙+TNF-α组PMVEC单层通透系数（Kf）也明显低于TNF-α组。表明甲强龙抑制TNF-α所致大鼠PMVEC单层通透性增加的同时,降低SSeCKS蛋白高表达水平。结论:1.体外成功培养鉴定大鼠PMVEC。2.从mRNA及蛋白水平证实大鼠PMVEC表达SSeCKS。3.TNF-α以时间及浓度依赖的方式上调大鼠PMVEC中SSeCKS的mRNA及蛋白表达。4.甲强龙在抑制TNF-α所致大鼠PMVEC单层通透性增加的同时,降低SSeCKS蛋白高表达水平。提示SSeCKS参与TNF-α诱导大鼠PMVEC单层通透性损伤,可能具有调控PMVEC单层通透性的作用。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 统计学处理
• 3.实验结果
• 3.1 大鼠PMVEC的分离、培养和鉴定
• 3.2 TNF-α对大鼠PMVEC上SSeCKS表达的影响
• 3.3 甲强龙干预结果
• 4.讨论
• 4.1 大鼠PMVEC的分离、培养和鉴定
• 4.2 TNF-α对大鼠PMVEC SSeCKS表达的影响及甲强龙的干预作用
• 4.3 SSeCKS调控PMVEC单层通透性的可能机制
• 5.结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述