辅助T细胞17(Th17)与调节T细胞(Treg)在局灶性脑缺血损伤中作用及机制研究

论文摘要

围术期脑缺血事件因其高死亡率（26%-60%）、高致残率越来越受到人们关注,尽管人们采取了多种救治方法,但效果仍不理想,究其原因是其发病机制未得到彻底阐明。但人们注意到:在局灶性脑缺血（focal cerebral ischemia,FCI）后一段时间里,脑损伤仍继续进行,并进一步加重,该损伤系缺血脑组织增强的局部炎性反应所致,故“炎性反应对缺血区脑组织的损伤要比缺血本身更严重”。提示:炎性反应状态的高低与脑组织神经功能损害程度关系密切,抑制“脑缺血后炎性反应”将成为脑缺血保护研究新的靶点。近年发现,辅助T细胞17（Th17）与调节性T细胞（Treg）在机体多种炎性疾病发生、发展中扮演重要角色。因为,具有特异性表达转录因子RORγt的Th17细胞在自身免疫性疾病及过敏反应中发挥重要促炎作用,而Th17细胞的这些作用是通过其特异性释放细胞因子白介素17（IL-17）上调炎性因子“瀑布样释放”实现的。而特异性表达转录因子Foxp3的Treg细胞则通过直接接触或释放抗炎细胞因子（如IL-10和TGF-β1）,维持免疫耐受,对抗炎性反应,同时,Treg细胞也可通过负性调控Thl7细胞的生成、功能及IL-17分泌发挥抗炎作用。因此,Th17与Treg细胞平衡状态在炎性免疫相关性疾病（自身免疫性疾病、中枢炎性疾病、器官移植等）的发展与预防中起着重要作用。新近研究证实:Th17细胞在中枢神经系统炎性疾病中起着重要作用,如多发性硬化（MS）等,此外,还发现Th17细胞及IL-17与缺血性脑损伤关系密切。基于暂时性或永久性脑缺血时,脑组织损伤实质为“脑缺血后炎性反应导致的局部组织损伤”的事实,且机体炎性反应直接受免疫调控影响,故此,我们提出以下设想:（1）脑缺血后可能存在Th17/ Treg细胞功能失衡,该失衡与脑缺血损伤同步、关联,此免疫调节失控进一步导致机体过度、过长的炎性反应的存在,致使脑损伤的进一步加重。（2）通过对Th17、Treg细胞多层面免疫干预,维持Th17/ Treg细胞功能平衡,可能具有抑制缺血脑组织局部炎性反应状态及强度、减轻脑缺血后损伤的保护作用,并据此提出“脑缺血后免疫干预的脑保护预案”思路。本研究系对上述第一步研究任务的完成,同时,也系2009年度国家自然科学基金面上项目资助项目（No.30872445）目的:以昆明小鼠短暂性大脑中动脉栓塞模型（tMCAO）为基础,拟证实小鼠脑缺血后存在Th17/Treg细胞平衡关系破坏,此失衡状态与脑缺血后炎性损伤程度之间存在同步、相关关系,为进一步揭示脑缺血后炎性损伤机制,开拓缺血性脑损伤治疗的新领域提供思路。方法:70只昆明小鼠随机分为模型组（n=60）和假手术组（sham,n=10）,模型组又分为6h、12h、24h、48h、72h及5d六个亚组（n=10/亚组）。采用腔内线栓法建立小鼠tMCAO模型;通过检测脑梗死容积及神经功能缺陷评分（NDS）观察缺血后脑组织损伤程度;通过免疫荧光染色观察Th17细胞在脑组织中的侵润;并应用流式细胞分析、ELISA、Western blot分别检测Th17及Treg细胞比率、相关细胞因子及特异性转录因子RORγt和Foxp3蛋白的变化。结果:脑缺血再灌注后,脑组织水肿加重,梗死容积增大,48h[（44.4±3.2）%]时达峰值,而后有所减小;神经功能学评分逐渐降低,神经功能逐渐恢复,5 d（2.2±0.45）较6 h（4.6±0.55）明显提高（P<0.05）;流式细胞分析发现,Th17细胞百分率在缺血后开始逐渐增多,24h时达最大值[（0.70±0.10）%,p<0.05,vs sham and 5d],而5d[（0.30±0.10）%]时又恢复至正常水平。与脑损伤程度变化一致;Treg细胞表现出相反变化,缺血后细胞数量逐渐减少,24h[（0.9±0.29）%]时处于低谷,近乎消失,而后逐渐升高,在5d[（3.2±0.49）%,p<0.05]时恢复甚至超过正常水平;Th17及Treg相关细胞因子缺血后的变化趋势与Th17细胞及Treg细胞相一致,但脑及血清中IL-17A却表现出随缺血时间延长而逐渐增多的趋势,在5d时达最大值（脑,77.9±5.11 pg/ml;血清,29.44±3.06 pg/ml）;Treg细胞特异性转录因子Foxp3与Treg细胞比率变化一致,而Th17细胞特异性转录因子RORγt却无明显变化;另外,通过免疫荧光染色我们观察到缺血坏死脑组织周边存在Th17细胞。结论:脑缺血后小鼠体内确实存在着Th17/Treg细胞平衡关系破坏,Th17及Treg相关炎性细胞因子缺血后的变化趋势与Th17细胞及Treg细胞比率变化相一致,两者与缺血脑组织损伤程度具有明显相关关系,初步认为:脑缺血后Th17/Treg细胞功能状态失衡,系通过免疫调控失控,放大、加重脑缺血局部炎性反应程度,参与脑缺血损伤的发展过程,纠正和维持Th17/Treg细胞平衡关系有望成为治疗脑缺血损伤的新靶点。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1. 炎性反应可加重缺血性脑损伤
• 2. T淋巴细胞参与脑缺血再灌注损伤过程
• 3. Th17细胞与Treg细胞在中枢神经系统中的作用
• 4. Th17/Treg细胞功能平衡状态影响炎性疾病的发生与发展
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢