抗镰刀菌毒素单链抗体与碱性磷酸酶融合蛋白的表达

论文摘要

由镰刀菌引起的赤霉病（Fusarium head blight or scab）是危害小麦（Triticumaestivum L.）等多种禾谷类作物的一种重要真菌病害,广泛分布于世界温暖潮湿地区,在我国南北麦区均有发生,是麦类中的重要病害。目前镰刀菌毒素检测比较常用的方法有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）,气相色谱法（gas chromatography,GC）,薄层层析法（thin layerchromatography,TLC）,高效液相色谱-质谱联用法（high performance liquidChromatography-mass sepectrum,HPLC-MS）,免疫学检测法等。本研究根据抗玉米赤霉烯酮单链抗体（single chain fragment viarable,scFv）和抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单链抗体基因的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好的密码子,采用重叠延伸PCR法人工合成单链抗体的重链和轻链,把重链和轻链用（Gly4Ser）2Linker连接,得到VH-Linker-VLscFv基因。将单链抗体-碱性磷酸酶（AP）融合基因分别构建到原核表达载体和酵母表达载体,进行大肠杆菌和酵母的表达研究,并对所表达的融合蛋白进行初步功能鉴定。研究结果表明,通过基因合成的方法成功获得与设计序列完全一致的单链抗体基因,改造了镰刀菌毒素抗体基因,并构建了单链抗体-碱性磷酸酶融合基因。融合基因经原核表达后,SDS-PAGE分析证实,融合蛋白虽然大部分形成包涵体,但上清中仍有少量可溶性蛋白。ELISA检测纯化后的融合蛋白表明,anti-ZEN-AP融合蛋白有碱性磷酸酶活性,而anti-DON-AP,D2-AP,anti-DONS-AP融合蛋白没有碱性磷酸酶活性。鉴于此我们在scFv与碱性磷酸酶间加入（Gly4Ser）3连接肽,把新融合基因构建到原核表达载体中,诱导表达后,经ELISA检测上清中的可溶性蛋白表明,anti-DONGS-AP,D2GS-AP融合蛋白有碱性磷酸酶活性;用D2GS-AP融合蛋白直接ELISA法检测禾谷镰刀菌细胞壁蛋白,说明D2GS-AP融合蛋白具有结合单链抗体和碱性磷酸酶活性的双重功效。将融合蛋白基因构建到酵母表达载体pPIC9K,电击转化入宿主菌GSll5,通过G418的筛选,对1 mg/mL G418有抗性的转化子被选出。为了进一步证实融合基因与毕赤酵母菌染色体基因组的整合,我们提取酵母菌总DNA,PCR分析阳性转化子。RT-PCR和Western blot分析经甲醇诱导的阳性转化子表明,anti-ZEN-AP,anti-DON-AP,D2-AP,anti-DONS-AP在酵母中正常转录,但只有anti-ZEN-AP,D2-AP有少量蛋白表达,所以还需要优化表达培养条件,使转化子可以在甲醇诱导条件下高效表达。因此,单链抗体与碱性磷酸酶融合蛋白可在大肠杆菌和酵母中稳定表达,这些研究结果为下一步建立灵敏、可靠且成本低的ELISA检测技术奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 文献综述
• 1.1 真菌毒素的研究现状
• 1.2 小麦赤霉病与真菌毒素
• 1.2.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇
• 1.2.2 玉米赤霉烯酮
• 1.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的检测方法
• 1.3.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法
• 1.3.2 玉米赤霉烯酮的检测方法
• 1.4 scFv的研究进展
• 1.4.1 单链抗体的设计和构建
• 1.4.2 scFv融合蛋白的构建
• 1.4.3 单链抗体的表达
• 1.4.4 单链抗体的应用
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及质粒
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 培养基及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒DNA提取
• 2.2.2 DNA片段回收
• 2.2.3 感受态细胞制备及转化
• 2.2.4 PCR扩增
• 2.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.6 蛋白诱导表达及纯化
• 2.2.7 ELISA检测禾谷镰刀菌细胞壁蛋白
• 2.2.8 Western blot检测目的蛋白
• 2.2.9 酵母表达载体的构建与转化
• 2.2.10 多拷贝数插入转化子的筛选
• 2.2.11 重组酵母的PCR鉴定
• 2.2.12 诱导表达阳性转化子
• 2.2.13 酵母总RNA和cDNA的获得
• 2.2.14 引物
• 3 结果与分析
• 3.1 单链抗体基因的设计与合成
• 3.1.1 抗ZEN scFv重链的合成
• 3.1.2 抗ZEN scFv轻链和抗DON scFv重链、轻链的合成
• 3.2 原核表达纯化和功能鉴定
• 3.2.1 原核表达载体的构建
• 3.2.2 原核蛋白表达
• 3.2.3 原核表达蛋白的功能鉴定
• 3.2.4 scFv和碱性磷酸酶融合蛋白间Linker的构建与表达
• 3.2.5. 融合蛋白活性鉴定和纯化
• 3.2.6 有无Linker融合蛋白表达量分析
• 3.3 酵母表达载体pPICscFvAP的构建与表达
• 3.3.1 PCR扩增单链抗体基因
• 3.3.2 真核表达pPICscFvAP系列载体的构建与鉴定
• 3.3.3 多拷贝数插入转化子的筛选
• 3.3.4 PCR快速鉴定阳性克隆
• 3.3.5 转基因毕赤酵母总RNA的提取以及RT-PCR分析
• 3.3.6 酵母诱导培养后SDS-PAGE检测目的蛋白质
• 3.3.7 Western blot检测外源基因的表达
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录