灰葡萄孢的细胞壁合成缺陷突变体筛选及几丁质合酶Ⅵ基因功能研究

论文摘要

本实验通过构建T-DNA插入突变体库筛选灰葡萄孢细胞壁合成缺陷突变株,以及通过基因敲除技术研究细胞壁几丁质合酶Ⅵ（BcchsⅥ）基因功能,目的是对灰葡萄孢细胞壁合成相关基因进行解析。实验利用带有双元载体ATMT1的农杆菌转化灰葡萄孢B05.10,筛选潮霉素抗性的转化子,经单孢分离和传代后得到234株遗传稳定的灰葡萄孢T-DNA插入突变株。用荧光增白剂Calcofluor White（CFW）对上述234株突变株进行细胞壁合成缺陷突变株的筛选,并获得了 3株对CFW敏感性（B-117、B-169、D-9）和 1 株对 CFW 抗性（B-62）的突变株。在进一步观察Sorbitol、SDS、NaCl对CFW敏感性突变体的影响实验中,发现1.2M Sorbitol对B-117和D-9的生长缓慢有挽救作用,野生型和B-117在NaCl培养基上的生长受到抑制。在孢子萌发实验中,B-62表现为菌丝长度和直径明显增加并出现了分枝,D-9的孢子膨大、菌丝较粗、长度增加而且不弯曲。在番茄感染实验中,D-9突变株侵染番茄的毒力大幅度减弱而B-62致病性却有所增强。由此推测B-62和D-9突变株与细胞壁缺损以及致病性有关。由于丝状真菌几丁质合酶Ⅴ和Ⅵ对于细胞壁几丁质合成十分重要,本研究室已对灰葡萄孢的几丁质合酶V基因开展了研究,但是发现几丁质合酶V基因敲除后几丁质含量增加了 31%,而致病力无明显变化。为了探明灰葡萄孢几丁质合酶Ⅵ基因功能,本实验利用Gateway技术构建几丁质合酶Ⅵ基因（BcchⅥ）敲除双元载体pCAMBIA-Bar-△chs6,以农杆菌介导法转化灰葡萄孢B05.10,得到9株潮霉素抗性突变株。经表型和分子鉴定后发现除第4号突变株（△4）外,其它的潮霉素突变株均为BcchsⅥ基因敲除突变体,推测△4突变株可能为异常插入突变株。实验对△2BcchsⅥ基因敲除突变株进行了详细研究,结果表明BcchsⅥ基因敲除突变株的几丁质含量下降了 22.5%、对CFW敏感、Sorbitol的生长挽救作用明显、产孢显著减弱、对蕃茄叶片的致病性下降。目前,对灰葡萄孢BcchsⅥ基因功能的解析仍在进行中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号和缩略语
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 灰葡萄孢致病相关基因的研究
• 1.2.1 HOG通路及相关基因功能的研究
• 1.2.2 灰葡萄孢抗氧反应的研究
• 1.2.3 灰葡萄孢分泌天门冬氨酸蛋白酶
• 1.2.4 灰葡萄孢BcFKBP12
• 1.2.5 灰葡萄孢与ABC转运因子
• 1.3 灰葡萄孢几丁质合酶的研究进展
• 1.3.1 灰葡萄孢几丁质合酶Ⅰ（BcchsⅠ）的基因功能
• 1.3.2 灰葡萄孢几丁质合酶Ⅲ（BcchsⅢ）的基因功能
• 1.3.3 灰葡萄孢几丁质合酶Ⅴ（BcchsⅤ）的基因功能
• 1.4 选题意义
• 第二章 构建灰葡萄孢突变体库
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 试剂和仪器
• 2.2.3 培养基
• 2.3 方法
• 2.3.1 菌株的活化和培养
• 2.3.2 农杆菌介导的灰葡萄孢的转化
• 2.3.3 转化子的筛选
• 2.3.4 转化子的分离纯化
• 2.3.5 突变株的单孢分离、生长速率的测量、观察及保存
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 灰葡萄孢突变株的筛选和单孢分离
• 2.4.2 灰葡萄孢突变株的生长速率及产孢情况
• 2.5 小结
• 第三章 利用CFW筛选灰葡萄孢突变体库中与细胞壁合成缺陷有关的突变株
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 引物
• 3.2.4 试剂和仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 确定最适CFW筛选浓度
• 3.3.2 利用CFW进行初筛
• 3.3.3 转化子的潮霉素抗性基因鉴定
• 3.3.4 对初筛转化子进行其它表型鉴定和孢子观察
• 3.3.5 突变株的致病性观察
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 CFW的最终筛选浓度
• 3.4.2 经过CFW初筛后的突变株表型
• 3.4.3 CFW敏感性突变株的潮霉素抗性鉴定
• 3.4.4 CFW敏感性突变株的其它表型
• 3.4.5 CFW敏感性突变株的孢子观察结果
• 3.4.6 CFW敏感性突变株对蕃茄叶片的侵染性实验
• 3.5 小结
• 第四章 灰葡萄孢几丁质合酶Ⅵ基因敲除菌株的构建
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 载体和引物
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 试剂和仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 克隆BcchsⅥ基因的上下游片段并连入入门载体pETHG
• 4.3.2 双元载体的构建
• 4.3.3 农杆菌介导的转化灰葡萄孢转化
• 4.3.4 敲除突变子的筛选
• 4.3.5 敲除突变株的分子鉴定
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 克隆BcchsⅥ基因的上下游片段并连入载体pETHG
• 4.4.2 双元载体的构建
• 1'>4.4.3 将双元载体pCAMBIA-Bar-△chs6转入感受态农杆菌AGL₁
• 4.4.4 农杆菌介导的灰葡萄孢转化
• 4.4.5 敲除突变子的筛选
• 4.4.6 敲除突变子的分子鉴定
• 4.5 小结
• 第五章 灰葡萄孢几丁质合酶Ⅵ的基因功能研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 菌株
• 5.2.2 试剂和仪器
• 5.3 方法
• 5.3.1 观察表型和测定生长速率
• 5.3.2 对CFW的敏感性测定
• 5.3.3 药物敏感性实验
• 5.3.4 番茄叶片侵染实验
• 5.3.5 BcchsⅥ基因突变株几丁质含量测定
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 突变株的表型和生长速率
• 5.4.2 对CFW的敏感性实验
• 5.4.3 对药物敏感性实验
• 5.4.4 番茄叶片侵染实验
• 5.4.5 葡糖胺含量标准曲线的制作
• 5.4.6 测定Bcchs Ⅵ基因突变株几丁质含量
• 5.5 小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录